Revista Tendencias en Docencia Año 4
e Investigación en Química Número 4
2018
Degradación biológica de lignina presente en 
residuos de nopal para la obtención de celulosa
Guzmán Gil Raymundo, González Brambila Margarita Mercedes, Álvarez Sánchez Carlos Saúl*, 
Guzmán Garduño Saúl
Universidad Autónoma Metropolitana, Departamento de Energía. Av. San Pablo No. 180, Azcapotzalco, Ciudad de 
México. C.P. 02200. México. 
* Autor para correspondencia: rggil@correo.azc.uam.mx
Recibido: RESUMEN 
13/mayo/2018
El presente trabajo tuvo como objetivo el desarrollo de un proceso 
biotecnológico para la obtención de celulosa. A partir de la fermentación 
Aceptado: de espinas de Opuntia ficus-indica proveniente del Residuo 
01/agosto/2018 Agroindustrial generado en la Delegación Milpa Alta, Ciudad de México. 
El microorganismo Pycnoporus cinnabarinus realizó la fermentación en 
un biorreactor homogéneo. En este trabajo se evalúo la eficiencia de la 
deslignificación, bajo diferentes condiciones de operación: pH de 4 y 6, 
temperatura de 30 °C y 50 °C, y un tamaño de partícula de 0.075 mm 
Palabras clave: y 0.25 mm. La deslignificación de la materia prima se evaluó mediante 
Celulosa, espectroscopia IR. Además se determinaron durante las fermentaciones 
espinas de nopal, las concentraciones de biomasa y azúcares reductores totales, empleando 
Pycnoporus cinnabarinus. el reactivo de Bradford y el método del ácido 3, 5- Dinitrosalicílico (DNS) 
respectivamente. 
Keywords: ABSTRACT 
Cellulose,
nopal spines, The objective of this work was the development of a biotechnological 
Pycnoporus cinnabarinus.  process to obtain cellulose. From the fermentation of Opuntia ficus-indica 
thorns from the Agroindustrial Residue generated in the Milpa Alta 
Delegation, Mexico City. The microorganism Pycnoporus cinnabarinus 
carried out the fermentation in a homogeneous bioreactor. In this 
work the efficiency of the delignification was evaluated, under different 
operating conditions: pH of 4 and 6, temperature of 30 °C and 50 °C, and 
a particle size of 0.074 mm and 0.25 mm. The delignification of the waste 
was evaluated by IR spectroscopy. In addition, the concentrations of 
biomass and total reducing carbohydrates were determined during the 
fermentations, using the Bradford reagent and the 3, 5- Dinitrosalicylic 
acid (DNS) method, respectively.
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Introducción Metodología
El desarrollo de procesos biotecnológicos para la Materiales y Métodos 
obtención de productos de valor agregado usando 
como materias primas los residuos sólidos urbanos Pretratamiento de la materia prima 
(RSU) ha ganado una gran importancia como campo 
de investigación. Las razones de esto radican en la En esta etapa se eliminó la humedad de la materia prima 
búsqueda de procesos más eficaces, eficientes y con un utilizando un horno de convección a 60° C, posteriormente 
menor impacto sobre el ambiente; y, por otro lado, el se trituraron las espinas, para después tamizar a dos 
aprovechamiento de una fuente abundante de materias tamaños de partícula (0.25 y 0.075) mm. Este proceso se 
primas, en este caso los materiales lignocelulósicos realiza con la finalidad de observar el efecto del tamaño 
(Bu´lock, 1991). de partícula como variable en la obtención de celulosa. 
Los materiales lignocelulósicos están presentes en Implementación de técnicas analíticas
la mayoría de los residuos agroindustriales, y su 
composición molecular se basa principalmente en Se realizaron curvas de calibración para cuantificar 
lignina, hemicelulosa y celulosa, entre otros. La celulosa azúcares reductores totales (ATR) el método del ácido 
tiene diversas aplicaciones en la industria, siendo la textil 3,5-Dinitrosalicilico (DNS) (Barrington, S. et al., 2009) y 
y la de la pulpa y el papel dos de las más importantes biomasa por el método de Bradford (Bradford, M., 1976) 
(Prinsen, 2010), sin embargo los procesos para obtener Para esto se utilizó un espectrofotómetro de UV-Vis, 
este producto suelen ser muy agresivos, utilizar mucha marca: PerkinElmer, modelo: lambda 45.
energía o producir residuos peligrosos (Rodríguez y 
Toca, 2006). Estos procesos se emplean para remover Cuantificación de azúcares reductores totales (ART) 
la lignina que es el compuesto que le brinda protección y lignina en la materia prima
a la mayoría de las plantas contra patógenos y agentes 
despolimerizantes (Chávez-Sifontes y Domine, 2013). Se cuantificó la lignina de la materia prima usando la 
norma TAPPI T-222-03-75 (Malainine, M. et al., 2003) 
Los hongos de podredumbre blanca han demostrado que consiste en cuantificar la lignina insoluble en ácido. 
ser microorganismos con la capacidad de biodegradar Después de la hidrolisis ácida se analizó el sobrenadante 
la lignina al producir enzimas ligninoliticas, Lignina por el método del DNS para determinar la concentración 
peroxidasas (LiP), manganeso peroxidasas (MnP), y lacasa de azúcares reductores. Además, se utilizó un 
(Lucas et al., 2001). Entre este tipo de microorganismos, espectrofotómetro infrarrojo marca Bruker, con óptica 
la especie Pycnoporus cinnabarinus ha demostrado ser FT-IR, modelo: Alpha, para monitorear la evolución en la 
eficaz en la despolimerización de la lignina a pesar de deslignificación.
solo producir lacasas. Esto se debe a que este hongo 
libera un metabolito; el ácido 3-hidroxiantranílico (3- Preparación de soluciones buffer
HAA) que, junto a la lacasa forma un sistema conocido 
como enzima-mediador. (Lucas et al, 2001) Así este Redactar nuevamente, podría ser: Se preparó una 
sistema de reacciones de óxido-reducción actúa sobre solución de NaOH al 0.2 M y una solución A con la 
el sustrato, en este caso la lignina, usando al oxigeno siguiente composición: Ácido acético al 0.04M, ácido 
molecular como aceptor de electrones el cual se reduce sulfúrico al 0.04 M y ácido bórico al 0.04 M. A 100 mL 
hasta agua (Eggert et al., 1996; Eggert et al., 1997). de la solución A se adicionaron 25 mL de la solución de 
NaOH para obtener una solucion buffer de pH 4 y para 
El propósito de este trabajo es utilizar al microorganismo la solución buffer de pH 6 a 100 mL de la solución A se 
Pycnoporus cinnabarinus, previamente adaptado añadieron 42.5 mL.
a producir lacasas, en un proceso fermentativo en 
estado líquido, bajo condiciones controladas de pH, Diseño experimental factorial 2k
Temperatura y tamaño de partícula de la materia prima 
para despolimerizar la lignina presente en las espinas de Se eligieron tres factores (variables independientes) con 
Opuntia ficus-indica y recuperar la celulosa, evaluando dos niveles por cada factor para evaluar la deslignificación. 
el grado de deslignificación mediante espectroscopia En la tabla 1 se muestra los factores, niveles reales y 
infrarroja. Se utilizó un diseño experimental factorial 2k codificados para el diseño de experimentación factorial 2k. 
con tres factores y dos niveles por factor. Para generar el diseño experimental factorial 2k se utilizó 
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el software Statgraphics Centurion XVII®, resultando 16 tiempo de 24 horas; cada muestra se filtró utilizando un 
corridas aleatorizadas para los 8 experimentos (con una equipo de filtración Millipore y se midieron para cada 
réplica por cada uno). muestra los parámetros siguientes: pH, temperatura, 
potencial óxido-reducción (ORP) y oxígeno disuelto (OD). 
Tabla 1. Niveles reales y codificados para el diseño experimental 
factorial 2k, para P. cinnabarinus. Al filtrado se le agregó 0.1 mL de HCl y se congeló 
para detener la reacción de la enzimas extracelulares, 
Variables Simbolo. Código y niveles Posteriormente se cuantificó azúcares reductores totales 
independientes reales por el método del DNS. La muestra sólida se seca a 35° C 
-1 1 durante 24 horas, para su posterior análisis de biomasa 
A: Tamño de partícula por el método de Bradford.
(mm) XA 0.25 0.075
B: pH (UpH) X 4 6 Al finalizar las fermentaciones, se separa el licor post-B fermentativo de la celulosa obtenida, la cual se esterilizó 
C: Temperatura (°C) XC 30 50 a 121° C y 15 psi, durante 15 minutos. Después se secó a 
35° C durante 24 horas y finalmente se analizó por 
Operación de los biorreactores, P. cinnabarinus espectroscopia IR. 
En esta etapa se usaron biorreactores con capacidad Usando el programa OPUS, versión 7.5, se integró el área 
para 1 L. En estos, se colocaron 10 g de materia prima bajo la curva de los espectros infrarrojos en el intervalo 
pre-tratada, 1 L de medio de cultivo con la siguiente de número de onda antes mencionado y así se obtuvieron 
composición: NaCl 0.32 g/L, KH2PO4 2.47 g/L, NH4NO3 los porcentajes de deslignificación que se presentaron en 
6.6 g/L, CaCl2 0.48 g/L, MgSO4•7H2O 0.38 g/L, FeSO4 la tabla 3.
0.124 g/L. El medio de cultivo y la materia prima se 
esterilizaron a 121 °C y 15 psi, durante 15 minutos. Resultados y discusión
Se inoculó cada biorreactor con 10 mL de una suspensión Porcentajes de deslignificación
que cuenta con los basidios inmovilizados adaptados a 
deslignificar (obtenidos previamente) y enriquecidos En esta sección se presentan los resultados obtenidos de 
con macro y micro elementos. Cada biorreactor contó con cada una de las dieciséis fermentaciones. Los datos que 
agitación mecánica, una toma de muestra y un difusor se mostrarán a continuación muestran los porcentajes de 
por donde entró aire, para controlar la temperatura de deslignificación alcanzados en función de los factores que 
los experimentos se utilizó un baño con recirculación, se controlaron en cada experimento, así como un estudio 
marca: Prendo, modelo: FC-06. En la tabla 2 se describe de espectroscopia IR que se le realizó a la materia prima 
la combinación de variables con la que operó cada y al producto final del proceso.
biorreactor. 
La tabla 3 muestra los porcentajes de deslignificación 
Tabla 2. Combinación del diseño de experimentación 2k, para alcanzados por las dieciséis fermentaciones, cada una 
P. cinnabarinus. con la combinación de variables que fueron controladas 
durante el proceso y definidas por el diseño de 
Experimento 1 50 °C*, 0.25 mm, pH 4 experimento
Experimento 2 50 °C, 0.25 mm, pH 6
Experimento 3 50 °C, 0.075 mm, pH 4 Tabla 3. Porcentajes de deslignificación alcanzados en cada 
fermentador en función de los factores controlados.
Experimento 4 50 °C, 0.075 mm, pH 6
Experimento 5 30 °C, 0.25 mm, pH 4 F tp (X ) pH. A (X ) T (XC) % dB
Experimento 6 30 °C, 0.25 mm, pH 6 F1 0.075mm 6 30°C 58
Experimento 7 30 °C, 0.075 mm, pH 4 F2 0.075mm 4 30°C 64
Experimento 8 30 °C, 0.075 mm, pH 6 F3 0.25mm 4 30°C 47
F4 0.25mm 6 30°C 57
Los biorreactores operaron durante 7 días, durante los F5 0.25mm 4 50°C 67
cuales se tomaron muestras de 10 mL a intervalos de 
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Tabla 3. Porcentajes de deslignificación alcanzados en cada se obtuvo un porcentaje promedio de deslignificación de 
fermentador en función de los factores controlados. (continuación) 65.5% aproximadamente, que es el valor más alto en lo 
referente a la despolimerización de la lignina. 
F tp (X ) pH. A (X ) T (XC) % dB Análisis por espectroscopía infrarroja
F6 0.075mm 4 50°C 17
F7 0.25mm 6 50°C 34 Los porcentajes de deslignificación se obtuvieron a partir 
del análisis por espectroscopía IR de la materia prima y del 
F8 0.075mm 6 50°C 17 material recuperado de los fermentadores. Se integró 
F9 0.25mm 4 30°C 50 el área bajo la curva del espectro IR en el intervalo 
F10 0.075mm 4 30°C 65 de número de onda de 1270 a 1220 cm-1 usando el 
F11 0.25mm 6 30°C 54 programa OPUS, versión 7.5, para obtener el porcentaje 
de deslignificación logrado en este experimento, dando 
F12 0.075mm 6 30°C 59 un valor del 67% aproximadamente.
F13 0.25mm 4 50°C 64
F14 0.075mm 4 50°C 16 En la figura 2 se muestran los espectros del sólido 
F15 0.25mm 6 50°C 38 recuperado de la fermentación F-5 comparado con 
el espectro de la materia prima. Basados en estudios 
F16 0.075mm 6 50°C 15 realizados por Zhao en 2014, las bandas características 
*F: fermentación, tp: tamaño de partícula, T: temperatura, %d: porcentaje de del grupo funcional C-O para el anillo aromático del 
deslignificación. alcohol sinapílico y el alcohol coniferílico se identificaron 
en el intervalo de número de onda antes mencionado 
con un tipo de vibración de tensión y una intensidad 
intermedia (Zhao, J. et al., 2014). 
Figura 2. Espectro IR de la materia prima y del sólido 
Figura 1. Gáfico de barras de los porcentajes de deslignificación recuperado del fermentador F-5.
que se presentan en la tabla 1.
Análisis estadístico 
En la figura 1 se presentan de manera gráfica los 
porcentajes de deslignificación de cada fermentación en Con base en el diseño factorial 2k, se realizó el análisis 
un periodo de 7 días que duró cada experimento. de varianza (ANOVA) para observar los efectos de las 
variables y sus interacciones en la despolimerización de 
Al analizar los datos de la figura 1 y de la tabla 3, se observó la lignina de las espinas del nopal. 
lo siguiente; el par de fermentaciones 5 y 13, en donde la 
segunda de estas es la réplica experimental de la primera, En la tabla 4 se presenta el ANOVA que particiona la 
con la siguiente combinación de variables: tamaño de variabilidad del porcentaje de deslignificación en piezas 
partícula de 0.25 mm, pH de 4 y temperatura de 50° C; separadas para cada uno de los efectos. 
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Tabla 4. Análisis de Varianza para Deslignificación Concluciones
Fuente Suma de Gl Cuadrado Cuadrados Medio Razón-F Valor-P En el presente trabajo se desarrolló un proceso 
biotecnológico, en el cual se estudiaron variables 
A: Tamaño de 
partícula 528.316 1 528.316 135.35 0.0000 elegidas para la deslignificación de las espinas de 
Opuntia ficus-indica usando a Pycnoporus cinnabarinus 
B:pH 184.15 1 184.15 47.18 0.0005 para obtener celulosa. Esas variables fueron tamaño de 
C: 1864.63 1 1864.63 477.70 0.0000 partícula, pH y temperatura. La despolimerización Temperatura
de la lignina ocurre por la actividad catalítica de 
AB 61.8556 1 61.8556 15.85 0.0073 las lacasas en combinación con el metabolito ácido 
AC 1657.08 1 1657.08 424.52 0.0000 3-hidroxiantranílico (3-HAA), ambos excretados por
BC 208.672 1 208.672 53.46 0.0003 el microorganismo y que interactúan en simbiosis con 
ABC 383.385 1 383.385 98.22 0.0001 el metabolismo de éstas. Las siguientes conclusiones se 
Bloque 0.0340071 1 0.0340071 0.01 0.9287 pueden extraer de este estudio.
3.90339
Error total 23.4203 6 • El porcentaje de deslignificación más alto (67.5 %) se
alcanzó con la combinación de variables: tamaño de
Total (corr) 5420.29 14 partícula 0.25 mm, pH de 4 y temperatura de 50° C.
El ANOVA se presenta con la finalidad de evaluar la • El análisis por espectroscopía infrarroja muestra una
significancia de cada efecto comparando su cuadrado disminución en la intensidad del anillo aromático del
medio contra un estimado del error experimental. En alcohol sinapílico y el alcohol coniferílico los cuales
este caso 7 efectos tienen un valor-P menor que α=0.05, se identificaron en el intervalo de número de onda de
indicando que son significantes con un nivel de confianza 1270 a 1220 cm-1
del 95 %.
• La despolimerización de la lignina está influenciada
En la figura 3 se presenta un diagrama de pareto principalmente por los efectos de la temperatura,
estandarizado, en dicho diagrama se pueden apreciar seguidos por la combinación de tamaño de partícula
los efectos estandarizados para los factores y sus y temperatura. El pH tiene una influencia baja, sin
combinaciones (en sus niveles codificados), C: embargo el efecto de esta variable es importante
temperatura, seguido de la combinación AC: tamaño al combinarse con el tamaño de partícula y la
de partícula y temperatura, por último, A: tamaño temperatura.
de partícula; son efectos estandarizados principales 
para este bioproceso. Se aprecia para B: pH, un efecto Agradeciemientos
estandarizado bajo, sin embargo, el pH tiene un efecto 
importante al combinarse con el tamaño de partícula y Se agradece el apoyo de Universidad Autónoma 
la temperatura. Metropolitana unidad Azcapotzalco en la realización y 
conclusión del presente proyecto.
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