DOI: 10.24275/uama.6737.9428 DIVISIÓN DE CIENCIAS BÁSICAS E INGENIERÍA Maestría en Ciencias e Ingeniería de Materiales “Síntesis de compósitos hidroxiapatita/colágeno a partir de residuos de pescado con orientación a la regeneración ósea” Tesis Presenta: Daniela Ayala Barajas Matrícula: 2183802791 Asesoras: Dra. Julia Aguilar Pliego Dra. Virginia González Vélez Depto. Ciencias Básicas, UAM-A Ciudad de México, agosto del 2021. 1 Agradecimientos ➢ Mi agradecimiento a CONACYT por brindarme el apoyo para iniciar y concluir este trabajo de investigación, que me ha dado la oportunidad de obtener un grado académico más y me ha permitido superarme. ➢ Agradezco la oportunidad que me brinda la Universidad Autónoma Metropolitana por abrirme una puerta al conocimiento que me permite ser mejor en todos los aspectos de mi vida. ➢ Agradezco al Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, especialmente al Laboratorio de Biofuncionalización de Superficies dirigido por la Dra. Marisela Vélez Tirado, por la oportunidad que me brindó para desarrollar la mayor parte de experimentación de este trabajo. ➢ Mi agradecimiento infinito a Dios y a mi familia (especialmente a mi mamá y a Pablo) por apoyarme en cada paso escolar que he dado, por estar siempre en los momentos más difíciles para ayudarme a sobre llevarlos. 2 Tabla de contenido Resumen ........................................................................................................................................ 5 INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 6 Marco teórico ................................................................................................................................. 6 Biomateriales ............................................................................................................................. 6 Ingeniería de tejidos ................................................................................................................. 7 Tejido óseo ................................................................................................................................ 8 Justificación ............................................................................................................................. 12 Hipótesis .................................................................................................................................. 12 Objetivos .................................................................................................................................. 12 Capítulo 1 ANTECEDENTES .................................................................................................. 13 1.1 Tilapia ........................................................................................................................... 13 1.2 Hidroxiapatita .............................................................................................................. 14 1.5 Colágeno ...................................................................................................................... 17 1.7 Regeneración de tejido óseo .................................................................................... 22 1.7.1 Materiales usados en regeneración de tejido óseo ........................................... 22 1.8 Pescados como fuente de hidroxiapatita y colágeno ........................................... 24 1.9 Compósito hidroxiapatita/colágeno .......................................................................... 25 Capítulo 2 METODOLOGÍA ..................................................................................................... 26 2.1 Diseño de experimentos ................................................................................................ 26 2.2 Extracción de colágeno ................................................................................................. 27 2.2.1 Colágeno a partir de escamas .............................................................................. 28 2.2.2 Colágeno a partir de piel ....................................................................................... 28 2.3 Síntesis de hidroxiapatita .............................................................................................. 29 2.3.1 Síntesis de hidroxiapatita a partir de escamas .................................................. 29 2.3.2 Síntesis de hidroxiapatita por precipitación ........................................................ 29 2.4 Síntesis de compósito hidroxiapatita/colágeno .......................................................... 30 2.5 Técnicas de caracterización fisicoquímicas ............................................................... 31 Capítulo 3 RESULTADOS ........................................................................................................ 33 3.1 Colágeno .......................................................................................................................... 34 3.2 Hidroxiapatita .................................................................................................................. 38 3.3 Compósito ........................................................................................................................ 43 3 Capítulo 4 CONCLUSIONES ................................................................................................... 49 Capítulo 5 PUBLICACIONES .................................................................................................. 50 Referencias ..................................................................................................................................... 60 APÉNDICE ...................................................................................................................................... 65 Este apéndice contiene información adicional sobre dos procedimientos experimentales que quedaron pendientes de realizarse para los biomateriales extraídos. ....................... 65 1. Esterilización ....................................................................................................................... 65 2. Pruebas de biocompatibilidad .......................................................................................... 66 4 Resumen El presente trabajo está enfocado en la síntesis de un compósito de hidroxiapatita y colágeno que pueda ser empleado en la regeneración de tejido óseo. Los precursores del compósito fueron extraídos de las escamas y piel del pescado Oreochromis hunteri y niloticus (tilapia). El colágeno se extrajo a partir de ambos residuos, mientras que la hidroxiapatita se obtuvo a partir de las escamas. Inicialmente este trabajo se basó en los métodos descritos por Liu et al., y Akkasit et al., para aislar colágeno soluble en ácido (CSA) y colágeno soluble en pepsina (CSP), y en el método de Ulfyana et al. para sintetizar la hidroxiapatita; en el desarrollo experimental se realizaron variaciones que logran resultados novedosos. Se pudo extraer colágeno tipo I tanto de la piel como de la escama, con mayor rendimiento para la piel, y que el polímero extraído presenta una estructura cuya longitud es menor a la reportada para el colágeno proveniente de mamíferos. El rendimiento obtenido fue similar al reportado por Liu et al. Con respecto a la hidroxiapatita, el material extraído de la escama no requirió de la adición del grupo fosfato, como se ha reportado en otros trabajos similares, ya que el material obtenido ya contenía fósforo. El análisis físicoquímico del material compósito mostró que tiene características adecuadas para ser aplicado en el área médica, ya que es un material poroso, rico en calcio, y enriquecido con sodio y magnesio. Además, el aspecto físico del compósito es muy parecido al hueso esponjoso. Teniendo en cuenta que la Tilapia es un pescado de alto consumo en México, lo que genera enormes cantidades de escamas y piel de desecho, el trabajo descrito en esta tesis es una propuesta de recuperación de estos desechos para extraer productos de alto valor agregado, como el Colágeno Tipo I, que puede ser aplicado en el área biomédica. 5 INTRODUCCIÓN El presente trabajo muestra la investigación desarrollada en torno a la síntesis de un material compósito de hidroxiapatita y colágeno que tiene la finalidad de convertirse en un biomaterial para aplicaciones médicas. Mas este es un trabajo preliminar para comenzar la exploración del material ya que se obtiene de residuos de pescado. Marco teórico Biomateriales Los materiales que se emplean en el área médica se denominan biomateriales, estos materiales tienen como objetivo reemplazar o desarrollar una función en algún tejido u órgano. En el pasado no había desarrollo específico de biomateriales basados en criterios científicos, sin embrago, al paso de los años esto se fue modificando y las bases científicas se han ido sentando. La evolución de la investigación en biomateriales se puede describir en cuatro etapas (1): • Primera generación: data de los años 60-70’s, donde los materiales representativos son el acero y polietileno, tuvo como objetivos el logro de propiedades físicas similares al tejido a reemplazar y la obtención de un material con el cual no reaccionara. • Segunda generación: tiene relación con el desarrollo de la industria aeronáutica y con materiales como el titanio y sus aleaciones, cuyas características relevantes son la inercia y pasividad, presentan alta probabilidad de aceptación, algunos de ellos llegaron a presentar inconvenientes en la adaptación al organismo. • Tercera generación: se presenta en los años 90’s, parte del principio de que no es el cuerpo el que debe adaptarse al material, sino a la inversa. Aparecen entonces el término de biomaterial activo para designar aquellos materiales que presentan similitudes en composición o superficie con el sistema biológico. • Cuarta generación: pretende obtener materiales que interactúen en profundidad con los sistemas biológicos mediante la regularización del proceso biológico, integrándose en el organismo, con una capacidad de degradarse y luchando contra infecciones. A estos materiales se les denomina inteligentes ya que adaptan sus propiedades al estímulo exterior o contienen sensores para vigilar las funciones e interactuar con los sistemas biológicos. Existen diferentes definiciones y ampliaciones de estas debido a los retos que enfrentan estos materiales ante su implantación en el cuerpo humano. La definición de biomateriales empleada por el Instituto Nacional Americano de Salud menciona que un biomaterial es cualquier sustancia o combinación de 6 INTRODUCCIÓN sustancias, que no sean drogas, sintéticas o de origen natural que se puedan usar durante cualquier periodo de tiempo, que aumente o reemplace parcial o totalmente cualquier tejido, órgano o función del cuerpo, para mantener o mejorar la calidad de vida del individuo (2). La revista “Biomaterials” define el biomaterial como una sustancia que ha sido diseñada para formar parte de un sistema complejo, usada para dirigir mediante el control de las interacciones con los componentes de los sistemas vivos, en cualquier terapia o tratamiento, así como en procedimientos diagnósticos. Los biomateriales son usados para reemplazar o mejorar la función de aquellos tejidos u órganos que han sido dañados o degradados. Esto permite mejorar la calidad de vida de los pacientes (3). Los biomateriales son materiales que presentan diferentes clasificaciones, desde su naturaleza hasta las propiedades que deben tener para ser considerados como tales. Dentro de su naturaleza se encuentran que pueden ser metálicos, cerámicos poliméricos o compósitos; en cuanto a sus propiedades se pueden clasificar en reabsorbible (tienen la capacidad de desintegrarse y absorberse en el tejido) y no reabsorbible que son contrarios a los anteriores. Para clasificar un biomaterial debe presentar algunas otras características como: Inerte: materiales que al estar en contacto con tejido no producirán reacciones químicas entre el implante y el tejido. Bioactivos: materiales que fomentan la unión con tejido circundante, su contraposición son materiales inactivos que causan una respuesta mínima o nula al tejido. Degradable: materiales que liberan gradualmente su masa en el tejido circundante y pueden disolverse por completo en un tiempo dado. No tóxico Compatible: en estos materiales, la respuesta del huésped con respecto a su implantación o presencia no pueden tener efectos adversos ni en el implante ni en el organismo huésped. Los biomateriales deben permitir el uso a largo plazo sin el rechazo del organismo huésped, ni perder su función prevista (2,3). Ingeniería de tejidos Ingeniería de tejidos es definida como un campo interdisciplinar que aplica los principios de ingeniería y ciencias de la vida hacia el desarrollo de sustitutos biológicos que restauran, mantienen o mejoran la función de un tejido (4). La ingeniería de tejidos evolucionó a partir del desarrollo de biomateriales y se refiere a la práctica de combinar andamios, células y moléculas biológicamente 7 INTRODUCCIÓN activas en tejidos funcionales. El objetivo de la ingeniería de tejidos es ensamblar construcciones funcionales que restauran, mantienen o mejoran el tejido dañado o un órgano completo (5). La aportación de la ingeniería de tejidos hacia la medicina regenerativa se basa en producir de forma continua tejidos y órganos que puedan integrarse en el cuerpo humano. Se distinguen tres modalidades de la ingeniería de tejidos (6): Sustitutos o aislamiento celulares: En esta metodología se extraen células del paciente a tratar, o de un donante, para ser multiplicadas in vitro. Posteriormente, se separan las células capaces de reparar el daño y se implantan en el sitio de la lesión. Comúnmente estas células son implantadas por inyección empleando un hidrogel biocompatible como vehículo, resultando en una técnica de mínima invasión quirúrgica que reduce las complicaciones. La principal desventaja de este método es la posible pérdida de la función celular y el rechazo inmunológico de células extraídas de donantes (6). Sustancias inductoras de tejidos: Esta técnica se basa en que las células responden a las señales bioquímicas de su entorno para formar su propia matriz, por lo que el éxito depende de la purificación a gran escala de moléculas capaces de estimular a las células que conforman al tejido para que ellas mismas reparen el daño (6). Matrices extracelulares sintéticas: En este enfoque, materiales macroporosos tridimensionales son empleados como medio para el trasplante o estimulación celular, actuando como guía en la restauración del tejido. Para cumplir el objetivo, la matriz ideal debe permitir la vascularización para suplir de nutrientes la estructura, puesto que las células localizadas a más de 150 µm de un vaso sanguíneo no sobreviven por falta de oxígeno. Además, la matriz debe ser biodegradable para permitir el crecimiento del nuevo tejido y desaparecer una vez se haya regenerado. La fabricación de órganos y/o tejidos in vitro listos para ser trasplantados al cuerpo humano. Se cultivan células sobre el material dentro de un biorreactor que proveerá un microambiente fisicoquímico adecuado para la diferenciación celular y la conjunción del tejido tridimensional. La implantación directa de materiales acelulares que promuevan la colonización del implante por las células localizadas en la vecindad de la lesión a tratar. Para lograr la restauración del tejido, el material debe estimular la migración celular, la vascularización y el remodelado del implante, mientras que el cuerpo humano suministra las células y las condiciones necesarias (6). Tejido óseo El tejido óseo es un tejido conjuntivo especializado en la función esquelética y de sostén, así como en la hematopoyesis (7). Es parte fundamental de del 8 INTRODUCCIÓN aparato locomotor, además posee una función metabólica central ya que es almacén de calcio (Ca). El Ca es un ion esencial en muchas funciones del organismo (contracción muscular, secreción y coagulación de sangre, entre otras). Además, en el hueso se almacenan magnesio, fósforo, sodio y otros iones (8). El hueso posee gran resistencia a la tracción y a la compresión. El hueso es un material compuesto por dos fases: fase mineral que es dura y una fase de matriz orgánica en relación estrecha con la primera y compuesta alrededor del 90-95% por colágeno tipo I (8). Matriz ósea Las características y propiedades específicas del hueso se deben a las propiedades de la matriz ósea. Dado que está calcificada, le imparte al hueso gran resistencia a la compresión y tracción. La composición especial de la matriz, consiste en fibrillas colágenas y sales inorgánicas (fosfato de calcio en forma de hidroxiapatita) (8). La matriz ósea está compuesta: • Material orgánico, alrededor de 35% (fibras de colágeno, proteínas óseas y proteoglucanos). • Material inorgánico, aproximadamente el 65% (sales). El colágeno totaliza alrededor del 90% del material orgánico del hueso, la parte inorgánica que compone al hueso consiste en una forma cristalina de depósitos del fosfato de calcio, la hidroxiapatita (Ca10[PO4]6[OH]2). La mineralización comienza en el colágeno, donde inicialmente se depositan los cristales de apatita en intervalos regulares (8). En la estructura macroscópica pueden distinguirse dos tipos de tejido óseo: Hueso compacto que se encuentra en la periferia de los huesos, es una masa sólida y dura. Hueso esponjoso se encuentra como un sistema tridimensional de espículas (trabéculas) óseas finas y ramificadas en el interior del hueso; entre las espículas quedan espacios amplios para tejido hematopoyético o adiposo. 9 INTRODUCCIÓN Hueso compacto o denso Hueso esponjoso Figura 1. Hueso maduro. Representación esquemática de la metáfisis. Se puede observar la parte de hueso denso y esponjoso (9). La estructura histológica de hueso maduro es igual en la sustancia compacta y esponjosa, se designa con el nombre de hueso laminar. Las unidades estructurales del tejido óseo maduro son laminillas óseas de 3 a 7µm de espesor (8). Tipos de células óseas Las células que componen al tejido óseo son de cuatro tipos: Células osteoprogenitoras (precursoras de osteoblastos), provenientes de células madre, presentes en el desarrollo del tejido óseo, al presentarse una fractura se pueden activar y dividirse. Osteoblastos son las células formadoras de matriz del hueso en crecimiento y maduro. Están conectados a través de nexos, además secretan colágeno, proteoglucanos, osteocalcina, osteopontina, osteonectina y otras proteínas. La matriz secretada inicialmente por estas células aún no está calcificada y recibe el nombre de osteoide. También desempeñan un papel en la degradación ósea. Los osteoblastos se transforman en osteocitos o mueren por apoptosis. Osteocitos son osteoblastos con modificaciones morfológicas. Osteoclastos se hacen cargo de la resorción de la matriz calcificada, son células de hasta 150µm de diámetro. 10 INTRODUCCIÓN Patologías Existen muchas enfermedades óseas (osteopatías), en las osteomalacias la porción inorgánica desciende a valores de hasta el 35%, dentro de las causas se encuentra una carencia de vitamina D o un aporte insuficiente de calcio y fosfato en los alimentos (8). Algunas de las entre las enfermedades que afectan al tejido óseo son las siguientes: • Osteoporosis: es la disminución local o generalizada del tejido óseo. • Osteosclerosis: se designa una hipertrofia circunscrita o general del hueso con aumento de la dureza y disminución de la capacidad de carga dinámica. • Osteosarcoma: es el tumor óseo maligno que se presenta frecuentemente entre 10 y 25 años. • Sarcoma de Ewing: otro tipo de tumor maligno que afecta a niños y jóvenes. 11 INTRODUCCIÓN Justificación A pesar de que existen publicaciones relacionadas con la obtención de colágeno e hidroxiapatita a partir de residuos de pescado, no hay reportes que describan la obtención de estos productos a partir de la especie Oreochromis hunteri, que es uno de los pescados que más se consumen en la región centro de México. Por otro lado, se han publicado algunos trabajos que reportan aplicaciones médicas de estos biomateriales, así como su biocompatibilidad, para otras especies de pescado. Por ello, en este proyecto se pretende sintetizar un biomaterial que favorezca la regeneración de tejido óseo a partir de los residuos del pescado Oreochromis hunteri. Hipótesis El colágeno y la hidroxiapatita obtenidos a partir de residuos del pescado Oreochromis Hunteri, tales como piel y escamas, sirven para sintetizar un material compósito biocompatible y útil para la regeneración de tejido óseo. Objetivos Objetivo general Sintetizar compósitos hidroxiapatita/ colágeno a partir de escamas y piel del pescado Oreochromis Hunteri (tilapia) para ser aplicados en la regeneración de tejido óseo. Objetivos particulares Aislar componentes orgánicos e inorgánicos de alto valor agregado a partir de un material de desecho. Sintetizar y caracterizar compósitos hidroxiapatita/ colágeno. Realizar pruebas de biocompatibilidad del material en cultivos celulares 12 Capítulo 1 ANTECEDENTES 1.1 Tilapia La tilapia es un pez que pertenece a la familia Cichlidae, al género Oreochromis. Las tilapias son peces endémicos de África y el cercano Oriente, han sido introducidas de forma acelerada hacia otros países tropicales o subtropicales, aparentemente son fáciles de cultivarse por lo que las llaman “gallinas acuáticas”, soportando la rusticidad para su manejo, alta adaptabilidad a diferentes condiciones del medio, fácil reproducción, alta resistencia a enfermedades, alta productividad, generalmente herbívoras aunque aceptan todo tipo de alimentos tanto naturales como artificiales (10). Las tilapias son introducidas en México desde 1964, tienen gran importancia en la producción de proteína animal. El cultivo de tilapia es de los más rentables porque es altamente productivo, debido a los atributos de la especie, capacidad para sobrevivir a bajas concentraciones de oxígeno y a diferentes salinidades (organismos eurihalinos), así como la aceptación de una amplia gama de alimentos naturales y artificiales. La acuacultura aporta el 91% de la producción de tilapia en México, y se cultiva en 31 estados de la República Mexicana, siendo los mayores productores: Chiapas, Tabasco, Guerrero, Estado de México y Veracruz (11). La morfología que presenta es de cuerpo robusto comprimido y discoidal, boca con labios gruesos; mandíbulas anchas con dientes cónicos y en ocasiones incisivos, aleta dorsal en forma de cresta con espinas y radios en su parte terminal, aleta caudal redonda y trunca. En la Figura 2 se muestra la apariencia física de la tilapia. El macho tiene dos orificios en la papila genital: el ano y el orificio urogenital, mientras que la hembra posee tres: el ano, el poro genital y el orificio urinario (11). a) b) Figura 2. Fotografía de Tilapia a) O. hunteri (12) y b) O. niloticus (13). La incubación de este pez es bucal y dura de 3-6 días. Los machos maduran de los 4-6 meses, y las hembras de los 3-5 meses, se desarrollan en ambientes acuáticos dulceacuícolas (ríos, embalses, arroyos y lagos) y salobres en lagunas costeras y estuarios (11). La reproducción se inhibe a temperaturas menores a 20 °C, y resulta letal menor a 11°C, la temperatura de desarrollo óptima se encuentra entre 24°C y 29°C, el 13 ANTECEDENTES oxígeno en agua debe estar entre 3 y 5 mg/l, un pH entre 6.5 y 8.5, el pH óptimo es de 7.5 (11). La Comisión Nacional de Acuacultura y Pesca (CONAPESCA) indicó que la tilapia se cultiva en aguas interiores en territorio nacional y su producción alcanza las 117 mil 806 toneladas anuales, siendo los estados más productores: Chiapas, con 28 mil 782 toneladas; Jalisco, 27 mil 739 toneladas; Michoacán, nueve mil 663 toneladas; Veracruz, ocho mil 762 toneladas; y Sinaloa, ocho mil 285 toneladas. Estas cinco entidades producen el 70 por ciento del volumen nacional de esta especie (14). Lo anterior posiciona a México en el noveno lugar a nivel mundial en producción de tilapia y entre los principales consumidores de este producto (14). 1.2 Hidroxiapatita La hidroxiapatita (HAp) es una forma mineral natural de apatita de calcio, con fórmula general Ca5(PO4)3(OH). La hidroxiapatita es el miembro del extremo hidroxilo del complejo grupo apatita, donde el ion OH puede reemplazarse por iones fluoruro, cloruro o carbonato. Esta cristaliza en el sistema hexagonal, tiene una gravedad específica de 3.08 y ocupa la quinta posición en la escala de dureza de Mohs. La Figura 3 muestra la estructura cristalina de la hidroxiapatita. Presenta una apariencia blanca en polvo, pero existen apatitas naturales en color marrón, amarillas o verdes por la presencia de impurezas de hierro(15). Se presenta como la fase cristalina termodinámicamente más estable de fosfato de calcio (CaP) en contacto con el fluido corporal (16). Figura 3. Estructura cristalina de hidroxiapatita (17). Los CaP son materiales compuestos de calcio y fosfato con relaciones molares diversas entre 0.5 y 2.0. Entre ellos se encuentra la hidroxiapatita (HAp) que es el principal biomaterial que imita al elemento mineral que poseen los huesos y dientes, siendo uno de los pocos minerales fisiológicos (18). Por lo tanto, muchos estudios informan que se utiliza comúnmente como recubrimiento o relleno para promover el crecimiento óseo en implantes protésicos. Algunos implantes óseos modernos 14 ANTECEDENTES están recubiertos con HAp, ya que se ha sugerido que este material podría promover la osificación (15). La hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) que constituye el sistema óseo presenta una relación molar de Ca/P de 1.67 en huesos y dientes. Es el principal componente de hueso con un tamaño de grano de 5 a 50nm (19). Este biomaterial exhibe notable bioactividad y biocompatibilidad en las aplicaciones biomédicas. Se ha utilizado como implante dental, protector del esmalte dental de la erosión ácida y exhibe efectos restauradores del esmalte y material sustituto óseo debido a sus propiedades no inflamatorias, no tóxicas y no inmunogénicas (18). Además, se ha utilizado con frecuencia como un relleno semipermanente en aplicaciones no quirúrgicas y en el rejuvenecimiento de la piel para tratar arrugas y cambios texturales de la misma (15). Sin embargo, la HAp difiere significativamente en términos de su micro y nano estructura de su equivalente biológico: el hueso cortical. La diferencia de las estructuras conduce a las malas propiedades mecánicas de la HAp sintética, como la fragilidad y baja tenacidad a la fractura, lo cual restringe sus aplicaciones en recubrimientos superficiales de implantes metálicos y sin carga (20). Existen diferentes técnicas para mejorar las propiedades que presenta el material cerámico, para esto se añaden impuresas, elaboración de compósitos y controlando la microestructura a través del método de síntesis empleado (20) 1.3 Métodos de síntesis Hasta ahora, se han desarrollado varios enfoques para la preparación y el procesamiento de HAp, que incluyen electrodeposición, precipitación química, método sol-gel, síntesis de llama, irradiación de microondas, síntesis solvotermal, síntesis hidrotérmica, método de neutralización, síntesis de baja presión, hidrólisis enzimática, método de precipitación y método de reacción en estado sólido (18). Existen diversos métodos de síntesis de HAp, Sadat-Shojai (16) engloba los métodos de síntesis en cinco métodos y estos a su vez los divide en submétodos como se muestra en la Tabla 1: • Método en seco, en este tipo de síntesis no se emplean solventes y las características de los polvos no están fuertemente influenciadas por los parámetros de procesamiento, por lo que los métodos secos no requieren condiciones controladas. o Se han sintetizado por procesos mecanoquímicos, o Síntesis en estado sólido para la preparación de las partículas de HAp. • Método de síntesis húmedo, con este método se obtienen partículas de tamaño y formas variadas, por ello se ha empleado convencionalmente a la síntesis de partículas de HAp que tienen estructuras nanométricas con morfología regular. Además, tiene ventajas en su capacidad para controlar la 15 ANTECEDENTES morfología y tamaño medio del polvo, así como su potencial aplicación en la fabricación de HAp nanométrica • Procesos de alta temperatura, para este tipo de síntesis se emplean temperaturas que queman total o parcialmente los precursores. • Síntesis basada en precursores biogénicas, es la síntesis de HAp cerámica generada parcial o completamente de precursores de origen biológico ya que presenta similitud a la apatita presente en el hueso humano. • Combinaciones de los anteriores métodos de síntesis con la finalidad de mejorar las propiedades del producto final. Tabla 1. Comparativa de diferentes métodos de síntesis de HAp (16). Características del polvo Método Submétodo Pureza Cristalinidad Relación Ca/P Tamaño de fase Estado sólido Muy alto Baja Variable Micro Seco Mecano-químico Muy alto Baja No estequiométrica Nano Precipitación Baja Variable No estequiométrica Nano química Hidrólisis Variable Alta Estequiométrica Variable Húmedo Sol-gel Variable (baja) Variable Estequiométrica Nano Hidrotermal Alta Alta Estequiométrica Nano o micro Emulsión Baja Variable No estequiométrica Nano Sonoquímica Variable Alta Variable Nano Combustión Variable Alta Variable Nano Alta Nano partículas temperatura Pirólisis Alta Variable Estequiométrica embebidas en micro-agregados Fuentes Variable Alta Variable Variable biogénicas Combinación Alta Alta Estequiométrica Nano de procesos 1.4 HAp a partir de fuentes biogénicas La HAp puede ser obtenida de diversas fuentes, entre ellas de desechos biológicos como las escamas de pescado, cáscara de huevo, conchas marinas y huesos de animales bovinos y porcinos, sin embargo, sigue siendo un desafío para lograr la HAp nanoestructurada (18). Así, como obtenerla a partir de reactivos químicos como nitrato de calcio tetrahidratado y fosfato monoácido de diamonio o ácido fosfórico e hidróxido de calcio, entre otros (21,22), En la tabla 2 se muestra una revisión bibliográfica de las fuentes biogénicas empleadas para la extracción de HAp. 16 ANTECEDENTES Tabla 2. Fuentes biogénicas para la obtención de HAp. Año Autor Producto Fuente biogénica Rendimiento Ref. obtenido (% en peso) 2011 Rajesh, R. HAp Huesos de pollo 60 (23) 2015 Mustafa, N. HAp Huesos y escamas 58 (24) de pescado 2016 Manoj, M. HAp Cascarón de huevo y No se (25) jengibre muestra 2018 Rincón, J. HAp Bovino No se (26) muestra 2018 Ulfyana, D. HAp Escamas de pescado No se (27) muestra 1.5 Colágeno • El colágeno es una proteína de la matriz extracelular que en conjunto con otras proteínas forman el andamiaje celular o citoesqueleto. Tiene un cometido estructural de importancia en la matriz extracelular (material que ayuda a mantener a las células juntas), en el tejido conectivo dentro de los órganos entre ellos el hueso. El colágeno más familiar es el de hueso (tipo I) y tendones (tipo II), que forman estructuras gruesas parecidas a cuerdas como se puede observar en la Figura 4. Este tipo de colágeno es una estructura trimérica de unos 3000Å de longitud, 15Å de diámetro y una distancia entre estrías de 67nm en estado hidratado nativo (28,29). Figura 4. Micrografía electrónica de fibras de colágeno (28). El colágeno es una de las principales proteínas estructurales del tejido conectivo de los vertebrados, constituye alrededor del 30% de sus proteínas totales. Está constituido en cadenas helicoidales de triple hélice, mostradas en la Figura 5, la 17 ANTECEDENTES unidad básica de la fibra de colágeno es la molécula de tropocolágeno, una hélice triple de tres cadenas polipeptídicas identificadas como cadena α, éstas contienen una o más secuencias de polipéptidos (glicina (Gly)-X-Y), donde X e Y corresponde a prolina e hidroxiprolina (19). El colágeno es una proteína helicoidal compleja que presenta una conformación dividida en cuatro estructuras: primaria que corresponde al triplete de aminoácidos, secundaria representa las hélices o cadenas α, la estructura terciaria es la triple hélice de la proteína y la estructura cuaternaria es la fibrilla de colágeno (7). En la Figura 6 se muestra la estructura del colágeno en algunas de las estructuras mencionadas anteriormente. a) b) c) d) Figure 5. Estructura del colágeno, a) estructura secundaria aminoácidos constituyentes representado en gris glicina, en anaranjado prolina y en rojo hidroxiprolina. b) Modelo de espacio lleno de un polipéptido. c) Modelo de espacio lleno de la triple hélice. d) Esqueleto que muestra los tres polipéptidos (28). Figura 6. Aminoácidos esenciales del colágeno (28). La triple hélice del colágeno es estabilizada por enlaces de hidrógeno. Una serie de interacciones unen el grupo N-H del esqueleto aportado por cada Gly a un grupo C=O del esqueleto de cadena. La geometría de la triple hélice impide que los grupos N-H y C=O de la estructura formen enlaces de hidrógeno entre sí, pero son capaces de interactuar con una red muy ordenada de moléculas de agua que rodean la triple hélice como una vaina (28). 18 ANTECEDENTES Naturalmente, el colágeno promueve la reparación de heridas promoviendo la coagulación sanguínea. El colágeno tipo I forma parte de la red que previene fallas mecánicas prematuras en la mayoría de los tejidos (30). Es considerado una proteína fibrosa que contribuye funciones únicas a la piel, tendones, hueso y cartílago. Existen 29 tipos de colágeno (31), sin embargo, el colágeno tipo I es más común en mamíferos y peces. El colágeno es ampliamente usado en las industrias cosmetológicas, biomédicas, farmacéutica por su excelente biocompatibilidad, biodegradabilidad y baja antigenicidad (32), se ha extraído de piel y huesos de animales bovinos y porcinos. Sin embargo ambos han presentado enfermedades transmisibles al humano, es por ello que se pretende extraer el colágeno de animales que no tengan la capacidad de transmitir alguna enfermedad, por lo tanto se ha propuesto la obtención del colágeno a partir de animales marinos (33) así como de la piel de patas de pollo (34). 1.5.1 Tipos de colágeno Existen 29 tipos de colágeno reportados en la literatura, sin embargo, la Tabla 3 muestra los más representativos. Tabla 3. Tipos de colágeno en el cuerpo humano (35). TIPO LOCALIZACIÓN FUNCIÓN Tejido conjuntivo de piel, huesos, tendones, Provee resistencia a I ligamentos, dentina, fuerzas, tensiones y esclerótica, aponeurosis y estiramiento. cápsulas de órganos. Cartílago (hialino y Provee resistencia a la II elástico) y discos compresión intermitente. intervertebrales. Provee sostén estructural Vísceras (útero, hígado, para las células bazo, riñón, etc.), III especializadas de músculo liso, vasos órganos diversos y para sanguíneos y piel fetal. los vasos sanguíneos. Láminas basales de epitelios, glomérulos Provee sostén y barrera IV renales y cápsula del de filtración. cristalino. 19 ANTECEDENTES TIPO LOCALIZACIÓN FUNCIÓN Forma parte de la matriz Fija el condrocito a la VI cartilaginosa que rodea matriz. los condrocitos. Presente en las fibrillas Adhesión de la lámina VII de anclaje de la piel, ojos, basal a las fibrillas del útero y esófago. tejido conjuntivo. Contribuye al proceso de mineralización ósea al Producido por formar redes condrocitos en la zona de X hexagonales necesarias hipertrofia del disco para organizar los epifisario normal. colágenos tipos II, IX y XI dentro del cartílago. Se desempeña en el Presente en encías, mantenimiento de la músculo cardiaco y arquitectura XXI esquelético y otros tejidos tridimensional de los humanos con fibrillas de tejidos conjuntivos colágeno tipo I. densos. 1.6 Antecedentes de la extracción de colágeno a partir de residuos de pescado. Al ser el colágeno una proteína estructural importante para la industria médica, farmacéutica, cosmética y alimenticia, se han investigado diversas fuentes para su obtención, entre las que destacan la extracción de colágeno a partir de piel y tendones de mamíferos (bovinos y porcinos) (36), patas de pollo y escamas de pescado (37). Recientemente, para aplicaciones médicas se ha optado por fuentes de extracción de colágeno más seguras, ya que algunos autores mencionan la posible transmisión de enfermedades hacia el receptor del colágeno, es por ello que se ha optado por optimizar los trabajos de aislamiento de colágeno en especies marinas (32). En la Tabla 4 se enlistan algunos de los trabajos realizados respecto a la extracción de colágeno a partir de residuos de pescado, resaltando el rendimiento y la región de extracción, así como la especie y el desecho empleado para la extracción. 20 ANTECEDENTES Tabla 4. Antecedentes de extracción de colágeno a partir de residuos de pescado. Rendimiento Región Año Especie Fuente [%] del Autor CSA CSP mundo 1996 Sardina Escamas -- 71.1 Japón Nomura (38) Lateolabrax Piel 51.4 -- japonicus (Lubina Huesos 40.7 -- japonesa) Aletas 5.2 -- Scomber japonicus Piel 49.8 -- (estornino) 2000 Japón Nagai (39) Heterodontus (tiburón toro o Piel 50.1 -- bullhead shark) Katsuwonus Hueso 42.3 -- pelamis (listado) Pagrus major Escama -- 2 (pargo japonés) 2003 Oreochromis Japón Ikoma(40) niloticus (tilapia del Escama -- 2 nilo) Sardina Escama -- 50.9 Lateolabrax japonicus (Lubina Escama -- 41 2004 Japón Nagai(41) japonesa) Pagellus Escama -- 37.5 bogaraveo Lutjanus vitta 2005 Piel 9 4.7 Tailandia Jongjareonrak(42) (pargo) Siganus fuscescens (pez Piel 3.6 -- conejo) Kyphosus bigibbus 2008 Piel 3.6 -- Japón Bae(43) (carpa marrón) Myliobatis tobijei Piel 3.5-5.7 --- Dasyatis akajei Piel 3.5-5.7 --- Dasyatis laevigata Piel 3.5-5.7 --- Piel 41.3 -- Cyprinus carpio 2009 Escama 1.35 -- China Duan(44) (Carpa) Hueso 1.06 -- Gadus morhua Columna 2010 20 -- Polonia Zelechowska(45) (Bacalao báltico) vertebral Parupeneus 2011 Escama 0.46 1.2 Tailandia Matmaroh(46) heptacanthus Pangasianodon 2011 hypophthalmus Piel 5.1 7.7 Tailandia Singh(47) (pez gato) Istiophorus 2013 platypterus (pez Piel 5.7 2.1 India Tamilmozhi(48) vela) Lates calcifer 2015 Escama 0.38 1.06 Tailandia Chuaychan(33) (barramundi) Ctenopharyngodon Piel -- -- 2015 idella (carpa Escama -- -- China Liu(49) herbívora) Aleta -- -- 21 ANTECEDENTES Oreochromis Escama 3.2 -- 2016 niloticus (tilapia del China Chen(50) Piel 27.2 -- nilo) Escama 6.5 -- Oreochromis ssp 2017 Piel 15.5 -- Colombia Quintero(51) (tilapia roja) Hueso 5.6 -- 2018 Dover sole Piel 19.2 -- India Arumugam(52) 1.7 Regeneración de tejido óseo La regeneración es el crecimiento de una parte afectada o perdida, específicamente para algún tejido. Los animales pueden regenerar algún tejido como la piel o el hígado. Si una parte del hígado es perdida o se lesiona por alguna patología, el hígado crece de nuevo a su tamaño original pero no con la morfología original (53). La medicina regenerativa es un campo nuevo de la medicina que pretende cambiar el curso de enfermedades crónicas, así como regenerar órganos que fallan por la edad, enfermedad, daño o defectos genéticos. Esta área incluye a la regeneración de tejidos, así como la autoregeneración, algunas veces necesita de materiales biológicos externos para reconstituir las células y así tejidos u órganos (53). El hueso natural es un ensamble complejo de nanofibras paralelas de colágeno tipo I y cristales de HAp. Dos tipos de células juegan un rol importante en la formación de hueso: osteoblastos (formadoras de hueso) y osteoclastos (absorbedores de hueso). Durante el proceso de osificación, los osteoblastos secretan colágeno tipo I y otras proteínas. La matriz extracelular puede no ser cristalina inicialmente, pero gradualmente se transforma en cristalina (7). En la regeneración de tejido óseo, el colágeno sirve como un andamio y permite iniciar la mineralización del hueso(7). 1.7.1 Materiales usados en regeneración de tejido óseo Los sustitutos de injertos óseos sintéticos tienen el objetivo de imitar la naturaleza física y mecánica del tejido nativo y promover la osteoconducción para la regeneración ósea, ésto mediante la liberación de fármacos y factor de crecimiento, los cuales se encuentran inmersos en el material). Algunos biomateriales se emplean para diseñar andamios biomiméticos, como polímeros naturales y sintéticos, cerámicas, metales y compuestos (54). 1.7.1.1 Cerámicos Una cerámica es un material inorgánico no metálico que puede poseer una estructura cristalina. Las cerámicas suelen tener alta resistencia a la compresión y 22 ANTECEDENTES baja ductilidad, lo que significa que proporcionan una alta resistencia a la deformación, pero tienden a fallar debido a su naturaleza frágil (54). Se han utilizado fosfatos de calcio, sulfatos de calcio y vidrio bioactivo como matrices para la regeneración ósea. Estas sustancias, especialmente los fosfatos de calcio son candidatos ideales para su uso como matrices porque el componente inorgánico del hueso está compuesto por la cerámica hidroxiapatita de calcio. El fosfato de calcio y el vidrio bioactivo también se consideran biomiméticos, ya que estimulan la formación, precipitación y deposición de fosfato de calcio de la solución y pueden dar como resultado una mayor resistencia de la interfaz hueso-matriz (54). La cerámica puede formar estructuras sólidas preformadas o formas inyectables que se endurecen in situ: ❖ Matrices preformadas Las matrices preformadas pueden diseñarse de diferentes formas tales como bloques, gránulos, polvos con estructura de poros, diámetro e interconnectividad cerca del hueso. Este tipo de matrices están indicadas en defectos en los que la forma se puede predecir en gran medida antes de la cirugía, como en la osteotomía, resección tumoral o fusiones espinales. La restauración de un segmento de hueso largo entrante que ha sido dañado como resultado de una lesión o extirpación de un tumor requiere matrices preformadas para la integridad estructural. ❖ Matrices inyectables Este tipo de matrices están indicadas para su uso en defectos trabeculares en los que el tejido esquelético dañado no soporta carga, en defectos contenidos cuando el tejido óseo estructural principal aún está intacto y en pequeños sitios de extirpación de tumores en el esqueleto apendicular. La principal ventaja de los cementos sobre las matrices preformadas es la capacidad de rellenar defectos a medida y aumentar la resistencia a la compresión. El material para matrices inyectables debe estar en estado líquido o gelatinoso y se endurecerá en un ambiente acuoso a 37°C (temperatura corporal). Esta propiedad permite que el polímero se inyecte en una cavidad o espacio con defecto óseo a través de una jeringa de calibre estrecho, minimizando el sitio quirúrgico a una pequeña incisión cutánea (54). 1.7.1.2 Polímeros Los polímeros biodegradables naturales, como el colágeno tipo I, la fibrina, el ácido hialurónico y el quitosano son materiales empleados en la regeneración de tejidos, sin embargo, el uso de estos materiales está limitado debido a su muy baja estabilidad mecánica. Existen polímeros sintéticos biodegradables, tales como polianhídridos, fumarato de polipropileno, policaprolactonas, polifosfacenos, 23 ANTECEDENTES polilactida, poliglicólico, y copolímeros asociados (polilactida-co-glicólico), son ampliamente utilizados como medios de andamiaje para ingeniería de tejidos (54). Los polímeros expresan diferentes atributos físicos, propiedades mecánicas, tiempos de degradación y modos de degradación que pueden elegirse sobre la base de la aplicación prevista de la matriz (54). 1.7.1.3 Metales Los metales porosos son una familia en expansión de estructuras o andamios porosos que tienen la característica innata de una estructura de poros interconectados tridimensionalmente comparable al hueso trabecular (54). Además, el titanio y el tantalio son biocompatibles, altamente resistentes a la corrosión, duraderos y no biodegradables con un módulo elástico muy similar al del hueso trabecular y pueden prepararse en muchas formas y texturas diferentes sin afectar su biocompatibilidad (54). Sin embargo, el carácter bioinerte de su óxido superficial protector de formación natural no forma fácilmente una interfaz fuerte con el tejido circundante. Además, la rigidez relativamente alta del titanio, en comparación con el hueso circundante, puede dar lugar a problemas de protección frente a tensiones y posterior aflojamiento del implante (54). 1.8 Pescados como fuente de hidroxiapatita y colágeno Recientemente se ha enfocado en la extracción de colágeno e hidroxiapatita a partir de componentes naturales que eviten la transmisión de enfermedades o que sean dañinos para el humano, se ha optado por extraer estos materiales a partir de pescado, sin embargo, no se tiene claramente los rendimientos de los materiales aislados ya que depende de varios factores como la especie, el manejo de los residuos del pescado y la técnica de aislamiento que se emplea. En la literatura se ha encontrado que la variación en el rendimiento de colágeno extraído de residuos de pescado puede deberse al pH ácido que gobierna durante precipitación con NaCl ya que proviene de una solución de ácido acético, es por ello que algunos equipos de investigación colocan un buffer durante el proceso de precipitación con NaCl (42). A nivel mundial, más del 50% de la captura de peces no se procesa como un producto alimenticio valioso y consta de millones de toneladas de desechos biológicos no deseados. Se desperdician enormes cantidades de subproductos de pescado y se genera un impacto ambiental no deseado. Recientemente, los desechos de escamas de pescado se han utilizado como una fuente de bajo costo para la preparación de HAp natural. La HAp preparada a partir de desechos de peces reveló mayor actividad biológica debido a la existencia de aniones esenciales como Cl- y F-, así como cationes (Mg2+, Al3+, Sr2+, Zn2+, K+ y Na+), la aparición de 24 ANTECEDENTES ambos iones muestra mejoras en las aplicaciones biomédicas, principalmente para la restauración ósea rápida (18). 1.9 Compósito hidroxiapatita/colágeno Los materiales compuestos se obtienen al unir dos materiales para conseguir una combinación de propiedades que no es posible obtener en los materiales originales. Estos compuestos pueden seleccionarse para lograr combinaciones poco usuales de rigidez, resistencia, peso, rendimiento a altas temperaturas, resistencia a la corrosión, dureza o conductividad (55). Los compuestos se pueden clasificar en tres categorías: con partículas, con fibras y laminares, dependiendo de la forma de los materiales. Un material compósito es definido como la mezcla de dos o más materiales que muestran mejores propiedades que los materiales individuales. Los constituyentes son un refuerzo y una matriz. Las principales ventajas de los compósitos son su alta resistencia y rigidez, combinadas con baja densidad, en comparación con los materiales individuales, lo que permite una reducción de peso en algunos materiales. La fase del material que corresponde al refuerzo proporciona la resistencia y rigidez (56). En la mayoría de los casos, el refuerzo es más duro, más fuerte y rígido que la matriz. El refuerzo suele ser una fibra o partícula. Los materiales compuestos en partículas tienen dimensiones que son aproximadamente iguales en todas las direcciones. Éstas pueden ser esféricas, plaquetas o cualquier otra geometría regular o irregular. Los compósitos de partículas tienden a ser mucho más débiles y menos rígidos que los compósitos de fibra continuas, generalmente son menos costosos. Los compósitos reforzados con partículas generalmente contienen menos refuerzo debido a dificultades de procesamiento y fragilidad (56). 25 METODOLOGÍA Capítulo 2 METODOLOGÍA La investigación que se describe en esta tesis se muestra en los párrafos siguientes. El objetivo fue extraer hidroxiapatita (HAp) y colágeno a partir de residuos de pescado que se obtuvieron en el mercado municipal de Azcapotzalco, así como del mercado “Maravillas” en Madrid, España. Las especies del pescado utilizado son Oreochromis Hunteri y Oreochromis Niloticus respectivamente, comúnmente conocidas como tilapia. 2.1 Diseño de experimentos Los experimentos que se realizaron en cada etapa de la investigación como la extracción de colágeno, síntesis de hidroxiapatita y la síntesis del compósito se muestran en las Tablas 5, 6 y 7 respectivamente. Se planteó realizar 12 experimentos en total teniendo en cuenta 5 experimentos para la extracción de colágeno, 5 de extracción y síntesis de HAp y 2 para la síntesis del compósito. Tabla 5. Experimentos para la extracción de colágeno. COLÁGENO PIEL ESCAMAS No. Experimentos No. Experimentos 1 Extracción de colágeno a partir 1 Extracción de colágeno a partir de Tilapia O. Hunteri. de Tilapia O. Hunteri. 2 Extracción de colágeno a partir 2 Extracción de colágeno a partir de Tilapia O. Niloticus. de Tilapia O. Niloticus. 3 Escalamiento. Tabla 6. Experimentos para la síntesis de HAp. HIDROXIAPATITA No. ESCAMAS No. SINTÉTICA 1 Siguiendo la metodología de 1 Siguiendo la metodología de Ulfyana para la extracción a partir Sequeda. de Tilapia O. Hunteri. 2 Siguiendo la metodología de 2 Escalar el experimento. Ulfyana para la extracción a partir de Tilapia O. Niloticus. 3 Escalar el experimento. 26 METODOLOGÍA Tabla 7. Experimentos para síntesis del material compósito. COMPÓSITO No. DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO 1 Mezcla del fosfato de calcio durante diálisis del colágeno. 2 Añadir fosfato de calcio durante la gelificación. Anteriormente se describieron los experimentos a realizar, en las tablas 8 y 9 se muestran el total de experimentos realizados para esta tesis, tanto las extracciones de los materiales precursores como del material compósito. Tabla 8. Total, de experimentos realizados para la extracción de precursores para el material compósito Material Cantidad de Cantidad de Cantidad de experimentos para experimentos para experimentos de O. hunteri O. niloticus HAp sintética Colágeno 1 2 0 HAp 1 3 1 Los experimentos relacionados a la extracción de colágeno solo se observó el rendimiento obtenido y el tipo de material extraído, el segundo experimento de O. niloticus fue un escalamiento del aislamiento para tener material disponible para la síntesis del material compósito. Tabla 9. Experimentos realizados para la síntesis del compósito. Relación de Cantidad de precursores experimentos colágeno/Hap 65/35 3 2.2 Extracción de colágeno El colágeno se obtuvo a partir de escamas y piel de los pescados siguiendo la metodología establecida por Liu con algunas modificaciones que se describen posteriormente (57). 27 METODOLOGÍA Materiales y equipos Los residuos de pescado se recolectaron de una pescadería ubicada en el mercado de la delegación Azcapotzalco, Ciudad de México y del mercado “Maravillas” en Madrid, España. Se utilizó hidróxido de sodio (NaOH) de Sigma Aldrich, ácido etilendiamino tetracético (EDTA), ácido acético, pepsina porcina, cloruro de sodio (NaCl), agua destilada, bolsa de diálisis de 7 a 30kDa, agitador magnético, cámara de enfriamiento, balanza granataria, centrífuga con control de temperatura, liofilizador. 2.2.1 Colágeno a partir de escamas 1. Recuperar las escamas del pescado, lavarlas con agua fría para eliminar todo residuo orgánico no deseado y almacenarlas hasta su utilización a una temperatura inferior a 4°C. 2. Sumergirlas en hidróxido de sodio a 0.1M con una relación 1:10 (p/v) por 36 horas con agitación continua y cambiando la solución cada 12 horas, esto con la finalidad de desproteinizar los residuos. 3. Descalcificar las escamas colocándolas en ácido etilendiamino tetracético (EDTA) 0.5M por 3 días, cambiando diario la solución. 4. Lavar con agua destilada. 5. Extraer los residuos y sumergirlos en ácido acético 0.5M que contenga pepsina porcina al 0.1% en una relación 1:10 (p/v), la pepsina solo se emplea para extraer colágeno soluble en pepsina, para extraer colágeno soluble en ácido no se requiere de la pepsina. 6. Centrifugar a 12,500 rpm durante 40 minutos a 4°C. 7. Añadir Cloruro de sodio (NaCl) 2M, precipitar y posteriormente centrifugar nuevamente con las características anteriores. 8. Añadir ácido acético (CH3COOH) 0.5M con una relación 1:10 (p/v). 9. Añadir Cloruro de sodio (NaCl) 2M, decantar y posteriormente añadir ácido acético (CH3COOH) 0.5M. 10. Dializar con agua destilada en una bolsa de diálisis con corte MW 7kDa. 11. Liofilizar el material obtenido. 2.2.2 Colágeno a partir de piel 1. Retirar la piel del pescado, lavarla con agua fría para eliminar todo residuo orgánico no deseado, mantener una temperatura inferior a 4°C. 2. Cortar la piel en cuadros de 0.5cm para facilitar la extracción química del colágeno, mismos que deben sumergirse en hidróxido de sodio a 0.1M con una relación 1:10 (p/v) por 36 horas con agitación continua y cambiando la solución cada 12 horas, esto con la finalidad de desproteinizar los residuos. 3. Eliminar la grasa de la piel, en este proceso los residuos se someten a una solución de alcohol butílico al 10% por 36 horas con cambio de solución cada12 horas, este proceso es exclusivo de la piel. 4. Lavar con agua destilada. 28 METODOLOGÍA 5. Extraer los residuos y sumergirlos en ácido acético 0.5M que contenga pepsina porcina al 0.1% en una relación 1:10 (p/v), la pepsina solo se emplea para extraer colágeno soluble en pepsina, para extraer colágeno soluble en ácido no se requiere de la pepsina. 6. Centrifugar a 12,000 rpm durante 40 minutos a 4°C. 7. Añadir Cloruro de sodio (NaCl) 2M, precipitar y posteriormente centrifugar nuevamente con las características anteriores. 8. Añadir ácido acético (CH3COOH) 0.5M con una relación 1:10 (p/v). 9. Añadir Cloruro de sodio (NaCl) 2M, decantar y posteriormente añadir ácido acético (CH3COOH) 0.5M. 10. Dializar con agua destilada en una bolsa de diálisis con corte MW 7kDa. 11. Liofilizar el material obtenido. 2.3 Síntesis de hidroxiapatita En cuanto a la hidroxiapatita (HAp), se obtendrá a partir de la escama del pescado antes mencionado siguiendo la metodología que plantea Ulfyana et.al. (27). Materiales y equipos Para la síntesis de HAp se emplearon los siguientes materiales y equipos: escamas de tilapia, hidróxido de sodio (NaOH) de Sigma Aldrich, papel filtro, agitador magnético con calentamiento, balanza granataria, horno de secado, horno de calcinación y termómetro. 2.3.1 Síntesis de hidroxiapatita a partir de escamas 1. Lavar con agua corriente las escamas para retirar residuos biológicos. 2. Hervir las escamas con agua por 30 minutos. 3. Lavar con agua destilada y posteriormente escurrir. 4. Sumergir en hidróxido de sodio (NaOH) al 1% durante 2 horas, posteriormente lavar con agua destilada y dejar secar a temperatura ambiente por 24 horas. 5. Secar en horno a 110° por 5 horas. 6. Calcinar por 5 horas a una temperatura de 950°C. 2.3.2 Síntesis de hidroxiapatita por precipitación 1. Colocar nitrato de calcio tetrahidratado (Ca(NO3)2 · 4H2O) en una concentración de 1M en un vaso de precipitados. 2. Añadir fosfato diamónico en una concentración 0.6M a una velocidad de 5mL/min. 3. Ajustar el pH, durante el proceso, entre 9 y 11 y con hidróxido de amonio (NH4OH). 4. Todo el proceso se realiza a 90°, posteriormente se deja en agitación continua por una hora. 5. Se deja en reposo por 72 horas que corresponde al proceso de envejecimiento. 6. Lavar hasta alcanzar un pH neutro, secar al ambiente por 24 horas. 29 METODOLOGÍA 7. Secar en un horno de secado por 1 hora a 250°C y calcinar a 1000°C durante 3 horas. 2.4 Síntesis de compósito hidroxiapatita/colágeno La síntesis del compósito reportada en la literatura se describe a partir de la síntesis de la HAp in situ (58), este proceso es mostrado en la Figura 7. En este trabajo la metodología cambia ligeramente, como se muestra en la Figura 6, ya que los materiales obtenidos son un fosfato de calcio y colágeno, eso quiere decir que la HAp ya está formada durante el proceso de extracción. Por ello se propone gelificar el colágeno siguiendo la metodología para la preparación de gel 3D propuesta por Advanced BioMatrix Innovative 3D Solutions y al mismo tiempo añadir el fosfato de calcio. La síntesis del material compósito de HAp/colágeno se realiza mediante la combinación de 0.085g de HAp, 0.046g de colágeno liofilizado, 7.6 ml de ácido acético 0.02M, 2.74ml de solución buffer de fosfato (PBS) y 100µl de NaOH 1N. Primero se disuelve el colágeno liofilizado en ácido acético a 0.02M, posteriormente se añade la HAp y se mezcla pipeteando. El proceso de gelificación y/o formación de colágeno fibrilar se efectúa a pH neutro para lo que se requiere añadir el PBS y el NaOH. Una vez mezclados estos compuestos se somete la solución a una temperatura de 37°C durante una hora. En la Figura 8 se muestra el esquema de la metodología que se describe anteriormente. Figura 7. Esquema de la síntesis del compósito HAp/colágeno propuesta por Sasmal et.al. 30 METODOLOGÍA Figura 8. Síntesis de compósito HAp/Colágeno. 2.5 Técnicas de caracterización fisicoquímicas Estas técnicas de caracterización permiten la identificación de los materiales a estudiar a través de procesos físicos y químicos que interactúan con las muestras. En las Tablas 10, 11 y 12 se muestran las técnicas de caracterización fisicoquímica que se emplearon para la identificación del colágeno, HAp y del material compósito, respectivamente. Tabla 10. Técnicas para la caracterización del colágeno. COLÁGENO TÉCNICA FUNCIÓN Electroforesis Análisis bandas por peso molecular. Microscopía de fuerza atómica (AFM) Análisis topográfico. Espectroscopía infrarroja (FT-IR) Análisis de grupos funcionales característicos. Tabla 11. Técnicas para la caracterización de HAp. HIDROXIAPATITA TÉCNICA FUNCIÓN Difracción de rayos X Determinar la estructura cristalina. Análisis de grupos funcionales Espectroscopía infrarroja (FT-IR) característicos. Microscopía electrónica de barrido Observar morfología de la superficie. (MEB) Analizar elementos presentes en la Análisis químico elemental (EDS) muestra y su relación molar. Analizar y corroborar elementos Análisis químico elemental (ICP) presentes en la muestra. Determinar la temperatura de calcinación Análisis termogravimétrico de la escama 31 METODOLOGÍA Tabla 12. Técnicas para la caracterización del material compósito. COMPÓSITO HAp/COLÁGENO TÉCNICA FUNCIÓN Espectroscopía infrarroja (FT-IR) Análisis de grupos funcionales característicos. Difracción de rayos X Determinar la cristalinidad. Microscopía electrónica de barrido Observar morfología de la superficie. 32 Capítulo 3 RESULTADOS Se ha extraído colágeno a partir de escamas y piel de pescado, se ha sintetizado HAp y se han procesado las escamas para la obtención de HAp. Los materiales se han sometido a algunas técnicas de caracterización y los resultados se describen a continuación. La primera caracterización realizada fue un análisis termogravimétrico (TGA) de la escama de tilapia para identificar la temperatura de calcinación, en la Figura 9 se muestra este análisis, en el cual se observa que no existe pérdida de masa a temperaturas superiores a 800°C, lo que confirma que la temperatura de calcinación de la escama ideal para extraer el óxido de calcio puede efectuarse a 900°C. La literatura menciona que la primera pérdida de masa se presenta entre 100 y 300°C representando una pérdida del 30%, la cual está asociada a la perdida de agua; a una temperatura entre 300 y 600°C se presentan pérdidas del 30 al 40% por descomposición de materia orgánica y una pérdida de masa entre 1 y 2% alrededor de 600°C representando la carbonización (59). En el análisis realizado en el laboratorio con una atmósfera de nitrógeno con una velocidad de flujo de 50mL/min y una rampa de calentamiento de 10°C/min hasta alcanzar 900°C. El resultado se muestra en la Figura 9, en la cual se observa una pérdida del 21% entre 0 y 110°C que se corresponde con la pérdida de agua, entre 120 y 550°C se muestra una pérdida del 60% que se corresponde con materia orgánica y alrededor del 18% que representa una descarbonización (pérdida de carbonos presentes en el carbonato de calcio) en temperaturas superiores a 600°C. Figura 9. Análisis termogravimétrico de escama de tilapia. 33 RESULTADOS 3.1 Colágeno Se ha extraído colágeno a partir de escamas y piel del pescado tilapia (Oreochromis hunteri y Oreochromis niloticus), el cual ha sido caracterizado por: ❖ Espectroscopía UV-Vis: técnica en la que se observa principalmente una banda de absorción característica entre 210 y 240 nm como lo reporta la literatura, (31,60) sin embargo, junto con esa banda de absorción se muestran algunas otras que podrían indicar alguna especie contaminante que se encuentre presente en la muestra. La Figura 10 muestra el espectro UV-VIS del colágeno, la banda característica que reporta la literatura se encuentra enmarcada en el recuadro verde, las siglas CPTdil corresponden a colágeno de piel de tilapia diluido mientras que CPT es colágeno que se encuentra en una dilución mínima. Las siglas CETdil y CET representan el colágeno diluido y con una disolución menor respectivamente, extraído a partir de escamas de tilapia. Al presentarse las bandas máximas de absorbancia entre el rango reportado en la literatura, se espera que sea colágeno el material obtenido, pero es necesario realizar otros análisis complementarios, que brinden la certeza de que el material extraído sea colágeno, por ejemplo, la cuantificación de hidroxiprolina por espectroscopía UV-Visible, electroforesis y microscopía de fuerza atómica (AFM). C=O, -COOH y CO-NH2 en cadena triple helicoidal polipéptica de colágeno. = Figura 10. Espectros UV-Visible de colágeno tipo I extraído a partir de Oreochromis hunteri. a) Se muestra el espectro del colágeno extraído de piel y b) es del colágeno extraído de escamas. ❖ Espectroscopía infrarroja (FT-IR): las muestras del colágeno aislado de piel y escamas se han caracterizado por esta técnica ya que en ella podemos observar grupos funcionales que son característicos de proteínas como el colágeno, en la Figura 11 se muestran los espectros obtenidos. Se puede observar que al compararlo con la literatura el espectro que tiene mayor parecido con el espectro reportado es del colágeno liofilizado, sin embargo la intensidad en la Figura 11 a) parece menor al compararla con la reportada en la literatura (57). 34 RESULTADOS Al graficar únicamente el colágeno extraído de escama de tilapia liofilizado, Figura 11 b) se corrobora que el espectro es muy similar al reportado ya que se encuentran los grupos amida I, II y III en las longitudes de onda 1630 cm-1, 1548 cm-1 y 1239 cm-1, respectivamente, en este espectro también se presentan bandas bien definidas en 2933 cm-1 y 3324 cm-1 que se corresponden con amida B y A, respectivamente. Según Doyle, las vibraciones que se presentan alrededor de las longitudes de onda 3400 y 3440 cm-1 se corresponden a estiramientos NH cuando el grupo NH de un péptido está asociado con un enlace de hidrógeno. Y respecto a las bandas de amida B, éstas están asociadas con el estiramiento asimétrico de metileno (CH2) (31). Figura 11. Espectros FT-IR de colágeno extraído de escamas y piel de tilapia. a) Colágeno de escamas en gel (azul), colágeno de escamas liofilizado (rojo) y colágeno de piel en gel (negro). b) Colágeno de escamas liofilizado, gráfico amplificado. 35 RESULTADOS En la Figura 12 a) se muestran los espectros en modo comparativo del colágeno extraído a partir de piel y escamas de tilapia y en la Figura 12 b) se muestra el ya reportado en la (ColEE y ColPE), es necesario destacar que el espectro se obtuvo en una solución gelosa, es por ello que aparece una banda significativa entre 3000 y 3500 cm-1 correspondiendose con enlance O-H de agua . Figura 12. a) Espectro FTIR de colágeno extraído de escamas y piel de O. niloticus (ColEEgel y ColPEgel, respectivamente) y colágeno extraído de escamas y piel de O. hunteri (ColEMgel y ColPMgel, respectivamente) b) Espectro obtenido de la literatura para fines ilustrativos. 36 RESULTADOS ❖ Microscopía de fuerza atómica (AFM): imágenes correspondientes a la Figura 13. En ellas se observan las fibras características del colágeno, presentando una distancia medida entre estrías de 63.14nm, con ello se puede corroborar una vez más la presencia del colágeno extraído. Se observa que el acomodo de estas fibras es aleatorio, la muestra en la cual se realizó este análisis fue neutralizada previamente y se obtuvo un gel con una concentración del 100% colágeno. Figura 13. Fibra de colágeno extraída de piel de Tilapia. ❖ Electroforesis: técnica reportada para corroborar la presencia del colágeno, en ella se realiza la separación de la proteína por su tamaño (peso molecular) y carga eléctrica. En la Figura 14 se muestra el gel electroforético con las bandas correspondientes al colágeno tipo I que se ha comparado con colágeno extraído de cola de rata. Como se puede observar, en la técnica empleada se presenta que el peso molecular de la proteína se encuentra entre 100 y 250kD haciendo referencia a las cadenas alfa 1 y alfa 2 que se encuentran presentes en el colágeno tipo I (1). 37 RESULTADOS Figura 14. Electroforesis de colágeno extraído de escamas y piel de pescado comparado con colágeno de cola de rata. (PM: colágeno extraído de piel de O. hunteri, PE: colágeno extraído de piel de O. niloticus, R: colágeno extraído de cola de rata, EM: colágeno extraído de escamas de O. hunteri, EE: colágeno extraído de escamas de O. niloticus y STD estándares de peso molecular de proteínas). Con las técnicas de caracterización antes presentadas se corrobora que la extracción de colágeno a partir de residuos de pescado es exitosa. Un parámetro que se pretende comprobar es el rendimiento que se obtiene en la extracción para el cual se emplea la ecuación mostrada abajo, obteniendo un rendimiento de la extracción de colágeno a partir de escamas de O. hunteri de 1.86% y de 2.05% para la extracción de colágeno a partir de piel, con respecto a la tilapia O. niloticus se obtuvieron 11.14% y 11.76% para la extracción de colágeno a partir de escamas y piel, respectivamente: Ec. 1 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙á𝑔𝑒𝑛𝑜 𝑙𝑖𝑜𝑓𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑜 (𝑔) (33) 𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜(%) = × 100 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑜 (𝑔) Con ello se comprueba que el método experimental que se siguió es repetible y que los datos reportados son muy similares a los obtenidos con esta especie, a pesar de las diferencias en condiciones ambientales de crecimiento. 3.2 Hidroxiapatita Se ha obtenido un fosfato de calcio a partir de las escamas de tilapia, para identificarlo se ha caracterizado por diversas técnicas como se muestra a continuación. Además, se sintetizó HAp en el laboratorio por el método de coprecipitación, a continuación, se presentan los resultados obtenidos de su caracterización. La síntesis de HAp a partir de escamas de pescado se ha realizado de acuerdo con la metodología establecida por Ulfyana et.al. (27), el proceso se ha culminado hasta 38 RESULTADOS la obtención de óxido de calcio a partir de las escamas de pescado, según lo reportado por Ulfyana et. al. El material obtenido se ha analizado por difracción de rayos X, microscopía electrónica de barrido a través de electrones secundarios y análisis elemental EDS. ❖ Microscopía electrónica de barrido: en la Figura 15a se muestran las imágenes del material extraído de escamas de O. hunteri, obtenidas con el equipo Zeizz SUPRA 55VP, mediante la técnica de detección de electrones secundarios. En la Figura 15b se muestran las micrografías obtenidas del material extraído a partir de escamas de O. niloticus con el microscopio electrónico Hitachi TM- 1000, por la misma técnica. En las micrografías de la Figura 15 a) se observa que se trata de un material que presenta una morfología de block y se aprecia que las estructuras aunadas al block tienen bordes curvos y granulosos, en ambas micrografías se muestra un material poroso (lo que es ideal para la proliferación y crecimiento celular) y que presenta rugosidad, así como una estructura densa de aglomerados (16). a) b) Figura 15. Micrografías MEB de fosfato de calcio obtenido de escamas de a) O. hunteri b) O.niloticus. ❖ Análisis elemental por espectroscopía de rayos x de energía dispersa (EDS): en esta técnica se corroboran los elementos constituyentes del material a analizar. En la Figura 16a se muestran los resultados del material extraído a partir de O. hunteri obtenidos a través de un análisis de polvos, a una velocidad de aceleración de 20kV. En la Figura 16b se muestra el análisis químico realizado al fosfato de calcio extraído a partir de escamas de O. niloticus. En estos resultados se muestra que el material extraído de escamas contiene fosfato, 39 RESULTADOS calcio, sodio, magnesio y carbono; la literatura menciona que estos metales en su forma iónica son beneficiosos en aplicaciones médicas (18). La relación molar de Ca/P de la muestra de tilapia O. hunteri es de 1.68 y 2.6 para la muestra extraída de tilapia O. niloticus, la relación se obtuvo dividiendo el % en peso del calcio entre el % en peso del fósforo. El carbono que se presenta en el análisis es resultado de la cinta doble cara de carbón sobre la que fue montada la muestra. La Figura 17 muestra la región sobre la cual se obtuvo el análisis elemental para ambas muestras. a) keV b) keV Figura 16. Análisis EDS del material obtenido a partir de escamas de a) O. hunteri y b) O. niloticus. 40 RESULTADOS a) b) Figura 17. Región del material extraído sobre la que se realizó el EDS, a) O. hunteri y b) O. niloticus. ❖ Difracción de rayos X (DRX): en la Figura 18 se muestran los difractogramas de los materiales obtenidos a partir de escamas indicando una similitud con hidroxiapatita que ha sido comparada con la simulación de hidroxiapatita obtenida con el software Mercury. Como se puede ver en el DRX, se confirma la presencia de una estructura similar a la de HAp, se observan reflexiones bien definidas lo que indica un material cristalino, además de la coincidencia con las reflexiones de la simulación de hidroxiapatita a partir de su CIF, obtenido de la página del centro de base de datos cristalográficos Cambridge1. Figura 18. DRX de escamas procesadas. 1 The Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC). Disponible en: https://www.ccdc.cam.ac.uk/ 41 RESULTADOS ❖ Análisis químico por plasma de acoplamiento inductivo (ICP): este análisis se realizó con la finalidad de corroborar los elementos químico de las muestras. En la Tabla 13 se muestran los resultados, encontrando similitud en la presencia de los elementos constituyentes de las muestras. Los materiales extraídos a partir de escamas de pescado presentan en su composición calcio y fósforo, principalmente, además de algunos otros elementos como magnesio y sodio en menor proporción. Cabe señalar la diferencia con la HAp sintética (HAps), en la cual sólo se observa la presencia de calcio y fósforo. Tabla 13. Análisis químico elemental (ICP) Nombre Linea Concentración (wt-%) P 15.09 HApOH Ca 37.29 Na 2.71 Mg 0.69 Al 0.00 HApON P 15.04 Ca 37.41 Na 1.14 P 15.01 HApsc Mg 0.4787 Ca 36.96 Na 0.8029 HAps P 14.43 Ca 39.81 HApsc: hidroxiapatita sin procesamiento químico, solo lavado, secado y calcinación. ❖ Análisis por infrarrojo (FTIR): en la Figura 19 se muestran los resultados del análisis por infrarrojo de la extracción de HAp a partir de las escamas de tilapia O. hunteri y niloticus. Se presenta en transmitancia, en este análisis se pueden observar bandas bien definidas alrededor de 575cm-1 y 608cm-1 que se atribuyen al modo de flexión del fosfato (PO 3- 4 ), también se muestran pequeñas bandas en 3568cm-1 y 629cm-1 que representan vibraciones de estiramiento del grupo hidoxilo (OH-), y las bandas entre 1047 y 1093cm-1 que representan el modo de estiramiento de PO 3- 4 . Además, en el espectro de hidroxiapatita extraída a partir de O. hunteri se presenta otra banda alrededor de 1419 y 1464cm-1 que está asociado con la flexión de HAp de carbonato tipo-B (61,62). 42 RESULTADOS Figura 191. Análisis por FTIR de hidroxiapatita extraída de tilapia O. hunteri (HApOH) y tilapia O. niloticus (HApON). 3.3 Compósito El material compósito fue caracterizado por algunas de las técnicas físicoquímicas empleadas en sus precursores. Como se puede apreciar, el material obtenido presenta una coloración blanca (Figura 20 a) con una estructura entretejida (Figura 20 b), muy parecido al hueso humano (Figura 21). Por otro lado, dado el colágeno extraído de piel presenta una coloración ligeramente beige, el compósito también presenta esta coloración (Figura 20 c), mientras que el material compósito extraído de escamas es más claro (Figura 20 d). En ambos casos, sigue presente la porosidad. 43 RESULTADOS a) b) c) d) Figura 20. Apariencia física del material compósito de HAp/colágeno sintetizado en una relación de 35/65. a) material sintetizado a partir de colágeno extraído de piel de O. hunteri (PM) y O. niloticus (PE), b) compósito en el que se puede apreciar la porosidad del material. c) compósito sintetizado con colágeno extraído de piel y d) compósito sintetizado con colágeno extraído de escamas. Figura21. Estructura interna del hueso humano, a) fotomicrografía electrónica de barrido de la arquitectura tridimensional del hueso esponjoso. b) Aspecto macroscópico, radiografía de fémur. Flecha señalando tejido óseo trabecular (esponjoso) (9). ❖ Análisis térmico: En la Figura 22 se muestra la gráfica donde se compara el compósito sintetizado a partir de colágeno extraído de piel e hidroxiapatita de O. niloticus (HAp1), HAp sintética fue empleada en el compósito identificado como HAp3 y para la muestra “HAp2” se utilizó HAp O. hunteri. En este análisis se muestra una diferencia significativa en la pérdida de peso en la muestra con HAp2 lo cual representa la presencia de impurezas presentes en la muestra extraída. En las muestras sintetizadas “HAp3 e HAp1” se muestran 44 RESULTADOS gráficas similares perdiendo peso en las mismas temperaturas lo que indica la estabilidad en la extracción de HAp a partir de escamas y que al inicio del calentamiento existe una pérdida del material orgánico (colágeno). Figura 22. Análisis térmico de material compósito. ❖ Análisis por infrarrojo (FTIR): En la Figura 23 se muestran los espectros IR de los materiales obtenidos, de arriba hacia abajo se muestra la HAp, colágeno y el material compósito con una relación 35% y 65% de sus componentes iniciales, respectivamente. Se puede observar la similitud que existe en los espectros de los materiales de partida con el compósito. Se muestra claramente que ambos materiales son constituyentes del material compósito. En la Figura 23 b) se muestra el espectro de un material compósito sintetizado por un método de mineralización intrafibrilar, al compararlo con el espectro que se obtuvo en el laboratorio, se muestra gran similitud en las bandas bien definidas que se sobresalen y que se corresponden con los materiales de inicio. 45 RESULTADOS a) b) Figura 23. a) Espectro FTIR de colágeno, HAp y el material compósito, b) imagen del espectro del compósito HAp/colágeno reportado en la literatura (63). 46 RESULTADOS ❖ Microscopía electrónica de barrido (MEB): en la Figura 24 se muestran las micrografías del material compósito, en ellas se pueden apreciar las fibras del colágeno que se entrecruzan y la presencia de HAp depositada sobre estas fibras, la HAp se puede observar en tonos más blancos y brillosos. En las imágenes se aprecia cierta porosidad en el material. Figura 24. Micrografías del material compósito HAp/colágeno. ❖ Hinchamiento o swelling: En este análisis se trata de observar el porcentaje de hinchamiento del material al sumergirse en agua o en PBS, para esta técnica se sigue la metodología descrita por Beladi y otros autores (64). Esta técnica se describe a partir de la ecuación 2, donde Ws es el peso en gramos del material después de ser sumergido y quitando el exceso de líquido y Wd es el peso en gramos del material compósito. Ec. 2: 𝑊𝑠 − 𝑊𝑑(𝑔) (64) 𝐻𝑖𝑛𝑐ℎ𝑎𝑧ó𝑛(%) = × 100 𝑊𝑑(𝑔) 47 RESULTADOS El PBS se preparó disolviendo 8g de cloruro de sodio (NaCl), 0.2g de cloruro de potasio (KCl), 1.44g de fosfato disódico (Na2HPO4) y 0.24g de fosfato monopotásico (KH2PO4) en 800ml de agua destilada. Después de ajustar el pH a 7.4 con HCl (1mol*L-1) volumen total de la solución 1L (65). En la Figura 35 se muestran las gráficas obtenidas de este proceso en las cuales se observa una disminución en la absorción de líquido cuando se trata de la solución búfer (PBS), esto se debe a la concentración de iones. a) AGUA 100% 90% 80% 70% PE SOLO LIOFILIZADO 60% PEHApM 50% PMHApM 40% PM 30% PE 20% EM 10% 0% 0 0.5 1.5 3 8 16 24 Tiempo (h) b) PBS 100% 90% 80% 70% PE SOLO LIOFILIZADO 60% PEHApM 50% PMHApM 40% PM 30% 20% PE 10% EM 0% 0 0.5 1.5 3 8 16 24 Tiempo (h) Figura 35. Hinchazón del material sintetizado en a) agua y en b) PBS. 48 Hinchazón (%) Hinchazón (%) Capítulo 4 CONCLUSIONES La extracción de colágeno e hidroxiapatita a partir de residuos de Tilapia ha sido exitosa, ya que se han obtenido rendimientos similares a los obtenidos por otros autores con especies diferentes. Las caracterizaciones muestran que el colágeno obtenido es de tipo I, aun cuando la longitud de las fibras constituyentes del colágeno extraído de piel y escamas de Tilapia es menor a la longitud del colágeno reportada en la literatura; el biomaterial cumple con las demás características principales del colágeno. La metodología para la extracción de hidroxiapatita es novedosa ya que no requirió de fosfato adicional como se reporta para otras especies, y al caracterizar el material obtenido, se confirmó la presencia de hidroxiapatita rica en Calcio enriquecida con Sodio y Magnesio. Respecto a los materiales compósitos que se sintetizaron, al combinar la hidroxiapatita con el colágeno extraído de piel se observa que el compósito tiene alta área superficial lo que nos da indicios de ser un material apto para el crecimiento celular. Esto se puede observar al comparar los resultados obtenidos por la técnica de fisisorción de los materiales compósitos. Al observar las fotografías del material sintetizado, se puede apreciar que a gran escala es un material poroso y de consistencia esponjosa con un gran parecido en textura al hueso humano. Esta observación indica también que será un material que pueda ser empleado en la regeneración ósea o en otras aplicaciones médicas. Queda pendiente la esterilización y las pruebas biológicas que se habían planteado inicialmente, pero que por la pandemia de Covid-19 no fue posible llegar hasta esa etapa. Con los resultados que se han obtenido se ha concretado la mayor parte del proyecto inicial que era sintetizar un material compósito de hidroxiapatita y colágeno a partir de desechos de pescado, y que sea viable como biomaterial para regeneración ósea. Es necesario remarcar que con el trabajo obtenido se han realizado dos publicaciones, una de ellas fue la presentación de los resultados obtenidos de la extracción de hidroxiapatita en un congreso internacional, y la otra fue una publicación en una revista nacional en la cual se revisa el estado del arte en cuanto a la extracción de colágeno a partir de residuos de pescado de diferentes especies en el mundo. 49 PUBLICACIONES Capítulo 5 PUBLICACIONES Este proyecto de tesis permitió realizar dos publicaciones: 1. Anaya-Barajas, D.; Aguilar-Pliego, J.; González-Vélez, V. y Vélez-Tirado, M. (2019) Biomateriales para regeneración de tejido óseo extraídos de desechos de pescado. Revista Mexicana de Ingeniería Biomédica, 40(3): e201927EE3. DOI: 10.17488/rmib.40.3.13. 2. D Ayala-Barajas, V González-Vélez, M Vélez-Tirado, J Aguilar-Pliego (2020) Hydroxyapatite extraction from fish scales of Tilapia. Proceedings of the 42nd Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society (EMBC): 2206-2208. DOI: 10.1109/EMBC44109.2020.9176479. 1. 50 PUBLICACIONES 51 PUBLICACIONES 52 PUBLICACIONES 53 PUBLICACIONES 54 PUBLICACIONES 55 PUBLICACIONES 56 PUBLICACIONES 57 PUBLICACIONES 2. 58 PUBLICACIONES 59 Referencias 1. Bonilla CEP, Perilla JE. The past, present and near future of materials for use in biodegradable orthopaedic implants. Ing e Investig. 2011;31(2):124–33. 2. Bergmann CP, Stumpf A. Biomaterials. In 2013. p. 9–13. Disponible en: http://link.springer.com/10.1007/978-3-642-38224-6_2 3. Hudecki A, Kiryczyński G, Łos MJ. Biomaterials, Definition, Overview. In: Stem Cells and Biomaterials for Regenerative Medicine. Elsevier; 2019. p. 85–98. 4. Langer R, Vacanti J. Advances in tissue engineering. Adv Tissue Eng. 2016;51:8– 12. 5. Institutes N. NATIONAL INSTITUTE OF BIOMEDICAL IMAGING AND BIOENGINEERING Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2013;(July). 6. Montufar E. Espumas inyectables de hidroxiapatita obtenidas por el método de espumado de la fase líquida de un cemento de fosfato tricálcico alfa . Universidad Politécnica de Cataluña. 2010. 7. Ferreira AM, Gentile P, Chiono V, Ciardelli G. Collagen for bone tissue regeneration. Acta Biomater [Internet]. 2012;8(9):3191–200. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.actbio.2012.06.014 8. Sabotta J, Welsch U. Histología. In: Histología. 2a ed. Editorial Medica Panamerica; 2006. p. 131–47. 9. Montalvo CE. Tejido Oseo. Fac Med Univ Nac Autónoma México [Internet]. 2010;21. Disponible en: http://bct.facmed.unam.mx/wp- content/uploads/2018/08/tejido_oseo_2010.pdf 10. Castillo L. Tilapia roja. Mundo Tilapia [Internet]. 2006;(6):1–124. Disponible en: https://mundotilapia.es.tl/Tilapia-Roja_Oreochromis-Sp-red.htm 11. Instituto Nacional de Pesca I. Acuacultura Tilapia [Internet]. 2018. Disponible en https://www.gob.mx/inapesca/acciones-y-programas/acuacultura-tilapia 12. Froese R and DP. World Wide Web electronic publication [Internet]. FishBase. 2020. Disponible en: https://www.fishbase.se/summary/Oreochromis-hunteri.html 13. Froese R and DP. World Wide Web electronic publication [Internet]. FishBase. 2020. Disponible en: https://www.fishbase.se/summary/2 14. CONAPESCA. México entre los diez primeros lugares a nivel mundial en producción de tilapia: SAGARPA | Comisión Nacional de Acuacultura y Pesca | Gobierno | gob.mx [Internet]. 2017. p. 2017. Disponible en: https://www.gob.mx/conapesca/prensa/mexico-entre-los-diez-primeros-lugares-a- nivel-mundial-en-produccion-de-tilapia-sagarpa-103606?idiom=es 15. Rigano L, Lionetti N. Nanobiomaterials in galenic formulations and cosmetics. Appl Nanobiomaterials. 2016;10:121–48. 60 REFERENCIAS 16. Sadat-Shojai M, Khorasani MT, Dinpanah-Khoshdargi E, Jamshidi A. Synthesis methods for nanosized hydroxyapatite with diverse structures. Vol. 9, Acta Biomaterialia. Elsevier Ltd; 2013. p. 7591–621. 17. Hydroxyapatite Ca5(OH)(PO4)3. Univ Liverpool [Internet]. 2020; Disponible en: http://www.chemtube3d.com/solidstate/SShydroxyapatite. htm 18. Sathiskumar S, Vanaraj S, Sabarinathan D, Bharath S, Sivarasan G, Arulmani S, et al. Green synthesis of biocompatible nanostructured hydroxyapatite from Cirrhinus mrigala fish scale – A biowaste to biomaterial. Ceram Int. 2019 Apr 15;45(6):7804– 10. 19. Bronzino JD. Tissue Engineering and Artificial Organs. Third Edit. Taylor & Francis Group, editor. New York, USA; 2006. 20. Song J, Liu Y, Zhang Y, Jiao L. Mechanical properties of hydroxyapatite ceramics sintered from powders with different morphologies. Mater Sci Eng A [Internet]. 2011;528(16–17):5421–7. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.msea.2011.03.078 21. Sequeda L, Díaz J, Gutiérrez S, Perdomo S, Gómez O. Obtención de hidroxiapatita sintética por tres métodos diferentes y su caracterización para ser utilizada como sustituto óseo. Rev Colomb Ciencias Químico - Farm. 2012;41(1):50–66. 22. Martínez-Valencia AB, Esparza-Ponce HE, Carbajal-De la Torre G, Ortiz-Landeros J. Caracterización estructural y morfológica de hidroxiapatita nanoestructurada : estudio comparativo de diferentes métodos de síntesis. Superf y Vacio. 2008;21(4):18–21. 23. Rajesh R, Hariharasubramanian A, Ravichandran YD. Chicken bone as a bioresource for the bioceramic (hydroxyapatite). Phosphorus, Sulfur Silicon Relat Elem. 2012;187(8):914–25. 24. Mustafa N, Ibrahim MHI, Asmawi R, Amin AM. Hydroxyapatite extracted from Waste Fish Bones and Scales via Calcination Method. 2015;774:287–90. 25. Manoj M, Subbiah R, Viswanathan C, Meena P, Mangalaraj D, Ponpandian N, et al. Paperr 30 PUBLICATIONS 192 CITATIONS SEE PROFILE Green Synthesis and Characterization of Bioceramic Hydroxyapatite (HAp) Nanosheets and Its Cellular Study. Adv Sci Eng Med. 2016;8:1–6. 26. Rincón-López JA, Hermann-Muñoz JA, Giraldo-Betancur AL, De Vizcaya-Ruiz A, Alvarado-Orozco JM, Muñoz-Saldaña J. Synthetic and Bovine-Derived Hydroxyapatite Ceramics : A Comparison. Materials (Basel). 2018;11(333):17. 27. Ulfyana D, Anugroho F, Sumarlan SH, Wibisono Y. Bioceramics synthesis of hydroxyapatite from red snapper fish scales biowaste using wet chemical precipitation route. IOP Conf Ser Earth Environ Sci. 2018;131(1). 28. Pratt. C, K. Cornely. Bioquímica. In: Moderno M, editor. 2a Edición. Ciudad de México; 2011. p. 138–47. 29. Sorushanova A, Delgado LM, Wu Z, Shologu N, Kshirsagar A, Raghunath R, et al. The Collagen Suprafamily: From Biosynthesis to Advanced Biomaterial 61 REFERENCIAS Development. Vol. 31, Advanced Materials. Wiley-VCH Verlag; 2019. 30. Silver F, Chriistiansen DL. Biomaterials Science and bioconpatibility Frederick H. Silver. New York, USA: Springer-Velag; 1999. 31. Wang J, Pei X, Liu H, Zhou D. Extraction and characterization of acid-soluble and pepsin-soluble collagen from skin of loach (Misgurnus anguillicaudatus). Int J Biol Macromol. 2018 Jan 1;106:544–50. 32. Liu D, Zhou P, Li T, Regenstein JM. Comparison of acid-soluble collagens from the skins and scales of four carp species. Food Hydrocoll. 2014;41:290–7. 33. Chuaychan S, Benjakul S, Kishimura H. Characteristics of acid- and pepsin-soluble collagens from scale of seabass (Lates calcarifer). LWT - Food Sci Technol. 2015 Sep 1;63(1):71–6. 34. Zhou C, Li Y, Yu X, Yang H, Ma H, Elgasim A, et al. Extraction and characterization of chicken feet soluble collagen. LWT - Food Sci Technol [Internet]. 2016;74:145– 53. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2016.07.024 35. Ross M, Wojciech P. HISTOLOGIA Texto y Atlas color con Biología Celular y Molecular. 5a ed. Médica Panamericana; 2007. 36. Bhagwat PK, Dandge PB. Collagen and collagenolytic proteases: A review. Vol. 15, Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. Elsevier Ltd; 2018. p. 43–55. 37. Araújo ÍBDS, Bezerra TKA, Nascimento ES Do, Gadelha CADA, Santi-Gadelha T, Madruga MS. Optimal conditions for obtaining collagen from chicken feet and its characterization. Food Sci Technol. 2018 Dec 1;38:167–73. 38. Nomura Y, Sakai H, Ishii Y, Shirai and K. Preparation and Some Properties of Type I Collagen from Fish Scales. Biosci Biotechnol Biochem [Internet]. 1996;60(12):2092–4. Disponible en: http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1271/bbb.60.2092 39. Nagai T. Isolation of collagen from fish waste material — skin, bone and fins. Food Chem. 2000;68(3):277–81. 40. Ikoma T, Kobayashi H, Tanaka J, Walsh D, Mann S. Physical properties of type I collagen extracted from fish scales of Pagrus major and Oreochromis niloticas. Int J Biol Macromol [Internet]. 2003;32(3–5):199–204. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12957317 41. Nagai T, Izumi M, Ishii M. Fish scale collagen. Preparation and partial characterization. Int J Food Sci Technol. 2004;39(3):239–44. 42. Jongjareonrak A, Benjakul S, Visessanguan W, Nagai T, Tanaka M. Isolation and characterisation of acid and pepsin-solubilised collagens from the skin of Brownstripe red snapper (Lutjanus vitta). Food Chem. 2005;93(3):475–84. 43. Bae I, Osatomi K, Yoshida A, Osako K, Yamaguchi A, Hara K. Biochemical properties of acid-soluble collagens extracted from the skins of underutilised fishes. Food Chem. 2008;108(1):49–54. 62 REFERENCIAS 44. Duan R, Zhang J, Du X, Yao X, Konno K. Properties of collagen from skin, scale and bone of carp (Cyprinus carpio). Food Chem. 2009;112(3):702–6. 45. Zelechowska E, Sadowska M, Turk M. Isolation and some properties of collagen from the backbone of Baltic cod (Gadus morhua). Food Hydrocoll. 2010 Jun;24(4):325–9. 46. Matmaroh K, Benjakul S, Prodpran T, Encarnacion AB. Characteristics of acid soluble collagen and pepsin soluble collagen from scale of spotted golden goatfish ( Parupeneus heptacanthus ). Food Chem [Internet]. 2011;129(3):1179–86. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2011.05.099 47. Singh P, Benjakul S, Maqsood S, Kishimura H. Isolation and characterisation of collagen extracted from the skin of striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus). Food Chem. 2011 Jan;124(1):97–105. 48. Tamilmozhi S, Veeruraj A, Arumugam M. Isolation and characterization of acid and pepsin-solubilized collagen from the skin of sailfish (Istiophorus platypterus). Food Res Int. 2013 Dec;54(2):1499–505. 49. Liu D, Wei G, Li T, Hu J, Lu N, Regenstein JM, et al. Effects of alkaline pretreatments and acid extraction conditions on the acid-soluble collagen from grass carp (Ctenopharyngodon idella) skin. Food Chem [Internet]. 2015;172:836– 43. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.09.147 50. Chen J, Li L, Yi R, Xu N, Gao R, Hong B. Extraction and characterization of acid- soluble collagen from scales and skin of tilapia ( Oreochromis niloticus ). LWT - Food Sci Technol [Internet]. 2016;66:453–9. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2015.10.070 51. Quintero J, Zapata JE. Optimización de la Extracción del Colágeno Soluble en Ácido de Subproductos de Tilapia Roja (Oreochromis spp) mediante un Diseño de Superficie de Respuesta. Inf Tecnol. 2017;28(1):109–20. 52. Arumugam GKS, Sharma D, Balakrishnan RM, Ettiyappan JBP. Extraction, optimization and characterization of collagen from sole fish skin. Sustain Chem Pharm [Internet]. 2018;9(April):19–26. Disponible en: https://doi.org/10.1016/j.scp.2018.04.003 53. Abu-Hussein AEHG. Introductory chapter: Concepts of Tissue Regeneration. Intech [Internet]. 2016;13. Disponible en: https://www.intechopen.com/books/advanced- biometric-technologies/liveness-detection-in-biometrics 54. Matassi F, Nistri L, Chicon Paez D, Innocenti M. New biomaterials for boneregeneration. Int Orthop. 2012;36(8):1583–8. 55. Askeland DR, Phulé PP. Ciencia e ingeniería de los materiales. 2004;669–721. 56. Weber DN, Shaw. CF, Petering DH. Introduction to composite materials. Struct Compos Mater. 2010;262(15):6962–4. 57. Liu D, Liang L, Regenstein JM, Zhou P. Extraction and characterisation of pepsin- solubilised collagen from fins, scales, skins, bones and swim bladders of bighead carp (Hypophthalmichthys nobilis). Food Chem. 2012 Aug 15;133(4):1441–8. 63 REFERENCIAS 58. Sasmal P, Begam H. Extraction of Type-I Collagen from Sea Fish and Synthesis of Hap/Collagen Composite. Procedia Mater Sci. 2014;5:1136–40. 59. Goto T, Sasaki K. Effects of trace elements in fi sh bones on crystal characteristics of hydroxyapatite obtained by calcination. Ceram Int [Internet]. 2014;40(7):10777– 85. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.ceramint.2014.03.067 60. Bhuimbar M V., Bhagwat PK, Dandge PB. Extraction and characterization of acid soluble collagen from fish waste: Development of collagen-chitosan blend as food packaging film. J Environ Chem Eng [Internet]. 2019;7(2):102983. Disponible en: https://doi.org/10.1016/j.jece.2019.102983 61. Pon-On W, Suntornsaratoon P, Charoenphandhu N, Thongbunchoo J, Krishnamra N, Tang IM. Hydroxyapatite from fish scale for potential use as bone scaffold or regenerative material. Mater Sci Eng C. 2016 May 1;62:183–9. 62. Ren F, Leng Y. Carbonated apatite, Type-A or Type-B? Key Eng Mater. 2012;493– 494:293–7. 63. Yu L, Rowe DW, Perera IP, Zhang J, Suib SL, Xin X, et al. Intrafibrillar Mineralized Collagen-Hydroxyapatite-Based Scaffolds for Bone Regeneration. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(16):18235–49. 64. Beladi F, Saber-Samandari S, Saber-Samandari S. Cellular compatibility of nanocomposite scaffolds based on hydroxyapatite entrapped in cellulose network for bone repair. Mater Sci Eng C [Internet]. 2017;75:385–92. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.msec.2017.02.040 65. Abd-Khorsand S, Saber-Samandari S, Saber-Samandari S. Development of nanocomposite scaffolds based on TiO2 doped in grafted chitosan/hydroxyapatite by freeze drying method and evaluation of biocompatibility. Int J Biol Macromol [Internet]. 2017;101:51–8. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.03.067 66. Brouwer KM, Versteeg EMM, Faraj KA, Geutjes PJ, Versteeg EM, Wismans RG, et al. The effect of ethylene oxide sterilisation, beta irradiation and gamma irradiation on collagen fibril-based scaffolds. Evaluation of biological, physical and chemical parameters. Autologous fat grafting in scars View project Combination of Sunitinib and cG250 for the treatment of patientes with mRCC View project Kaeuis Faraj The Effect of Ethylene Oxide Sterilisation, Beta Irradiation and Gamma Irradiation on Collagen Fibril-Based Scaffolds [Internet]. Vol. 8, Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2011. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/215596280 67. Parenteau-Bareil R, Gauvin R, Berthod F. Collagen-based biomaterials for tissue engineering applications. Materials (Basel). 2010;3(3):1863–87. 68. Romero A. Estudio de composites de hidroxiapatita y quitosano para su aplicación como biomateriales. Universidad Autónoma Metropolitana; 64 APÉNDICE Este apéndice contiene información adicional sobre dos procedimientos experimentales que quedaron pendientes de realizarse para los biomateriales extraídos. 1. Esterilización Antes de emplear los materiales en cultivos celulares es necesario que se lleve a cabo un proceso de eliminación de microorganismos que contaminen el cultivo celular y que este sea el factor de lisis celular. Para el desarrollo y crecimiento celular es importante que se encuentren en un ambiente libre de microorganismos patógenos para lo que se requiere que los materiales a sembrar en las células no estén contaminados y de esta forma poder corroborar la interacción o afectación que el material pudiese tener con las células. En la literatura se encuentran diferentes técnicas de esterilización que pueden ser aplicadas en materiales que contengan colágeno, (66) entre ellas se encuentran: ❖ Esterilización por rayos gamma de baja dosis ❖ Esterilización con óxido de etileno ❖ Esterilización con rayos beta ❖ Esterilización química (inmersión en concentración baja de ácido peracético o en ácido fórmico) ❖ Esterilización por inmersión en etanol con antibióticos y fungicidas. Es importante remarcar que al tratarse de una proteína como constituyente del material compósito se debe tener presente la fragilidad de ésta para ser sometida a un proceso de esterilización. Es necesario destacar que todas las técnicas de esterilización pueden alterar la estructura molecular y con ello modificar las algunas de las propiedades físicas del material, entre las afectaciones se puede encontrar la disminución de la resistencia mecánica (67). 65 APÉNDICE 2. Pruebas de biocompatibilidad Estas pruebas permiten identificar la viabilidad y biocompatibilidad que presentan los materiales al ponerlos en contacto con un medio similar al del cuerpo humano (células y líquidos corporales). La caracterización biológica de los materiales se debe realizar para determinar la viabilidad y adhesión celular a los materiales. Se necesitará una línea celular, su medio de cultivo, suero fetal bovino, antibiotico-antimicótico (anti-anti) y un buffer. Las células se pueden cultivar mediante el kit de cultivo que incluye el medio, suero fetal bovino, anti-anti y el Buffer a una temperatura de 37°C (68). Se sugiere la siguiente secuencia de pasos: ● Para los cultivos celulares, se hará un sembrado de células en cajas de Petri de las muestras y el control de los cultivos, estos últimos servirán para comparar el comportamiento celular. ● Se colocarán pequeñas cantidades de los materiales compósitos a diferentes concentraciones en las cajas Petri. ● Posteriormente se colocarán las células en un tubo eppendorf de 15mL, centrifugar a 1200 RPM por 6 minutos para formar un botón celular. ● Añadir 5.5mL de medio de cultivo y posteriormente se re-suspendió el botón celular. ● Incubar las células, el medio de cultivo será cambiado cada tercer día. Cultivar por 5 días. ● Para corroborar la viabilidad celular se realizaron los siguientes pasos: ● Retirar del medio de cultivo, posteriormente lavar con buffer de fosfato salino, colocar 2mL del buffer, retirar suavemente por las paredes y volver a colocar 2mL del buffer para retirar el medio de cultivo de las células y el material. ● Preparar buffer con Calceina-AM y Homodimero de estudio en la concentración sugerida por el kit. ● Colocar 500microL de la solución antes preparada en cada caja Petri, meter a la incubadora por 30 minutos. ● Proteger las cajas Petri de la luz durante su transportación al microscopio confocal. ● En cuanto a la adhesión celular es necesario: ● Preparar un buffer de fosfato de sodio dinástico + fosfato de sodio monobásico 0.1M con pH de 7.4. ● Retirar el medio de cultivo como se realizó anteriormente, repetir este lavado 5 veces. 66 APÉNDICE ● Retirar el buffer de fosfato + sales y agregar el fijador celular (glutaraldehído), sellar con parafina y refrigerar a 4°C por 24 horas. ● Realizar un lavado con buffer de fosfato, posteriormente colocar 2mL del buffer, retirar suavemente por las paredes y volver a colocar 2mL del buffer fosfato + sales, realizar este lavado cada 10 minutos de 3-5 repeticiones. ● Posteriormente se realizará la deshidratación en alcoholes iniciando con 30% con una rampa del 10% hasta alcanzar una concentración puerta de etanol, entre cada solución se realizarán 3 lavados cada 10 minutos. Encapsular las muestras para secarlas y realizar la caracterización por microscopía electrónica de barrido. En la Tabla 14 se muestran los materiales y porcentajes a los cuales se sugiere realizar las pruebas biológicas. Tabla 14. Relación de muestras biológicas sugeridas. PRUEBAS BIOLÓGICAS PORCENTAJE No. MATERIAL [%] 1 Control (cultivo celular) 100 2 Colágeno de piel de pescado 100 3 Colágeno de escamas de pescado 100 4 Colágeno comercial 100 5 HAp de escamas de pescado 100 6 HAp sintética 100 7 HAp de pez + colágeno de piel 65/35 8 HAp de pez + colágeno de escama 65/35 9 HAp sintética + colágeno de piel 65/35 10 HAp sintética + colágeno de escama 65/35 11 HAp sintética + colágeno comercial 65/35 67