Revista Tendencias en Docencia e Investigación en Química Año 2 Número 2 Año 2016 Embrioprotección por ácido fólico en ratas SHR tratadas con nifedipino Chirino Galindo Gladys1, Delgado Contreras Fernando2, González Ríos Axel Rubén2, Liera Carranza René2, Palomar Morales Martín1. 1Universidad Nacional Auto noma de Me xico. Laboratorio de Metabolismo de la Diabetes Mellitus, Unidad de Morfología y Funcio n, Facultad de Estudios Superiores Iztacala. Avenida de los Barrios No. 1, Los Reyes Iztacala, C.P. 54090. Tlalnepantla. Estado de Me xico. 2Universidad Nacional Auto noma de Me xico. Módulo de Metodología Científica, Carrera de Biología, Facultad de Estudios Superiores Iztacala. Avenida de los Barrios No. 1, Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, C.P. 54090. Estado de Me xico. * Autor para correspondencia: gchirinog@hotmail.com Recibido: RESUMEN El nifedipino es un fármaco antihipertensivo que a veces es suministrado a mujeres 19/abril/2016 en etapa gestacional con hipertensión, aunque presenta un posible riesgo teratogénico. Se sabe que el ácido fólico puede ayudar a un mejor pronóstico de la Aceptado: gestación. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del ácido fólico sobre las 16/agosto/2016 malformaciones causadas por el nifedipino durante el desarrollo embrionario de rata SHR, Se utilizaron 16 ratas SHR hembras, asignadas a 4 grupos, que fueron tratados respectivamente con nifedipino, ácido fólico, nifedipino más ácido fólico, o vehículo. Al día 11.5 de gestación, las ratas fueron sacrificadas y los fetos fueron analizados Palabras clave para malformaciones. Se observó que el nifedipino produce una elevada tasa de Teratoge nesis, nifedipino, malformaciones, también observadas en el grupo que recibió vehículo; y que el ácido ratas SHR fólico revierte el daño en ambos casos. Se concluye que el ácido fólico puede prevenir las malformaciones que el nifedipino causa. Keywords ABSTRACT Teratogenesis, nifedipine, Nifedipine is an antihypertensive drug that sometimes is prescribed to pregnant women with high blood pressure, although it presents a possible teratogenic risk. It SHR rats is largely know that folic acid could help to ameliorate pregnancy prognostic. The objective of this study was to assess whether folic acid can prevent malformations caused by nifedipine in SHR rat embryo development. Sixteen SHR female rats were randomLy assigned to 4 groups, which were treated respectively with nifedipine, folic acid, folic acid plus nifedipine, or vehicle. At day 11.5 of gestation, rats were sacrificed, and the fetuses were obtained and analyzed for malformations. It was observed that nifedipine produced a high rate of malformations, which were also observed in the group that received vehicle; and that folic acid reverses damage in both cases. The main conclusion is that folic acid could prevent the malformations caused by nifedipine without affect hypertension. Universidad Autónoma Metropolitana QV92 Revista Tendencias en Docencia e Investigación en Química Año 2 Número 2 Año 2016 Introducción El nifedipino causa reducción de la fuerza de contracción cardiaca en dosis de 7.2-28.8 μM a embriones de conejo Se define como teratogénesis o dismorfogénesis a la de 13 días de gestación in vitro (Abela, et al., 2010); en alteración morfológica, bioquímica o funcional, inducida embrión de rata en cultivo, a dosis de 1 μM produce durante el embarazo, y que es detectada durante la deterioro severo de la función cardiaca por efecto gestación, en el nacimiento o con posterioridad. Un antrópico negativo, reduciendo contracción de aurículas teratógeno es un agente capaz de causar un defecto y ventrículos en el corazón (Nilsson, et al., 2012). En congénito, y puede ser un factor ambiental o químico. conejo, es teratogénico a dosis de 40 a 100 μmol de peso Entre los químicos se encuentran los fármacos que son por día (Danielson et al., 1989). recetados a mujeres en gestación, siendo estos contraindicados para su uso durante ésta etapa, ya que Por otra parte, se sabe desde hace mucho tiempo que el manifiestan un mayor riesgo de que el neonato nazca con ácido fólico es un factor que puede ayudar a un desarrollo alguna malformación. Los efectos de un agente embrionario exitoso (Hibbard y Smithells, 1965), si bien teratógeno se pueden manifestar en forma de aborto hay pocos estudios que respalden su beneficencia en espontáneo u óbito, retraso del desarrollo intrauterino, condiciones adversas experimentales. Recientemente, se defectos anatómicos, tumores, alteraciones funcionales observó que el ácido fólico administrado a ratas de órganos sensoriales y sistema nervioso central preñadas tratadas con ácido valproico (un anticonvulsivo (Pagano, 1991), y generalmente se detectan al momento con poder teratogénico potente), reduce las del nacimiento (excepto aborto y óbito). Cualquier malformaciones causadas por éste fármaco sobre tubo fármaco que cause bradicardia o arritmia en el embrión neural y sistema óseo (Aluclu et al., 2009); y que la es potencialmente peligroso en el embarazo (Abela et al., administración de ácido fólico a ratonas diabéticas 2010). gestantes reduce las malformaciones de cierre de tubo neural y de sistemas cardiaco y esquelético causadas por La hipertensión arterial es una complicación frecuente el estado diabético (Oyama et al., 2009). durante el embarazo, ya que afecta entre 40% y el 70% de las mujeres en este estado; cuando no se trata puede El presente trabajo se realizó con el propósito de causar daños en el cerebro, el corazón, los vasos determinar si el ácido fólico es capaz de revertir o sanguíneos, los riñones y otras partes del cuerpo, prevenir las malformaciones que el nifedipino produce acarreando importantes riesgos para la madre y el feto, y sobre el desarrollo embrionario. Para este fin, se constituye una de las principales causas de mortalidad utilizaron ratas de la cepa SHR (spontaneously fetomaterna en el mundo; es la primera causa de muerte hypertensive rat), que presentan hipertensión en la materna en los países desarrollados y la tercera en los etapa adulta, lo que representa un modelo fiable, además países en vías de desarrollo, además de aumentar el que en general la rata tiene un sistema inmune similar al riesgo de infarto cardiaco, apoplejía, insuficiencia de los seres humanos, un breve periodo gestacional (20- cardíaca y renal, pérdida de la visión y otros problemas 21 días), es de fácil manejo y con un genoma muy similar (Hernández, 2009), así como afecciones fetales como la al de nuestra especie (Rivera et al., 2013). restricción de crecimiento intrauterino (Voto, 2008). Metodología El nifedipino (o nifedipina) es un fármaco antihipertensivo que pertenece a los medicamentos Reactivos bloqueadores de los canales de calcio, gracias a lo cual El ácido fólico fue obtenido en el Instituto Mexicano del inhibe el mecanismo contráctil de las células vasculares Seguro Social (IMSS), en presentación de comprimidos con la consiguiente vasodilatación de las arterias coronarias y los vasos periféricos. Se usa para tratar la de 4 mg de ácido fólico. El nifedipino se compró en una presión arterial alta y controlar la angina de pecho, en farmacia local, en presentación de capsulas con 10 mg del dosis de 10-30 mg al día por vía oral. La Food and Drugs fármaco, bajo el nombre comercial de Cordilab®, Administration (FDA) de los EUA, clasifica su potencial Tecnofarma S.A. de C.V. Los demás reactivos utilizados teratógeno en la categoría C, lo que indica un posible fueron de las marcas Sigma Chemical Co, Merck, o J.T. riesgo para el desarrollo embrionario, pero por Baker, y se obtuvieron en el Módulo de Metodología negligencia o desconocimiento médico aún es Científica III. suministrado a mujeres en etapa gestacional que padecen de problemas de hipertensión arterial (FDA, 2015). Universidad Autónoma Metropolitana QV93 Revista Tendencias en Docencia e Investigación en Química Año 2 Número 2 Año 2016 Obtención de material biológico malformaciones, y se registró la presencia de reabsorciones (tejido amorfo sanguinolento). Se obtuvieron de la División de Investigación y Posgrado de la FES Iztacala 16 ratas de la cepa SHR, hembras, Índice de implantación vírgenes, sexualmente maduras, de 12 a 14 semanas de Se obtuvo a partir del cociente del número de edad, con un peso de 150 a 200 g, que se mantuvieron en implantaciones sobre el número de cuerpos lúteos, como el bioterio de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, una medida de la eficiencia reproductiva; ya que un a temperatura de 22-24 °C, con humedad ambiental del fármaco o extracto que causa una pérdida de 50-60%, con ciclos luz: obscuridad de 12:12, iniciando a implantación mayor al 50% no es considerado las 8:00 AM, con agua y alimento (LabDiet 5010) ad teratogénico sino tóxico (Erb, 2006). libitum. Todos los procedimientos realizados con los sujetos experimentales se ajustaron a la NOM-062-ZOO- Score morfológico 1999 y fueron aprobados por el Comité de bioterio de la Los embriones se observaron al microscopio Facultad. estereoscópico Leica y se tomaron imágenes fotográficas Apareamiento y frotis con una cámara Moticam 5.0, en las cuales se interpretó el score o marcador morfológico, que es una manera de Las ratas hembra se aparearon con machos sanos, asignar valores numéricos a diferentes estructuras del fértiles, de 250 a 300 g de peso, de la misma cepa, por el embrión (Brown y Fabro, 1981). método de trio, y al día siguiente se realizó un frotis vaginal, para observar al microscopio la presencia de Análisis histológico espermatozoides; cuando el frotis resultó positivo se Los embriones se fijaron en formol al 10%, por 24 h. consideró como día cero de la gestación (Erb, 2006). Posteriormente fueron deshidratados, aclarados, Tratamientos embebidos e incluidos en parafina grado histológico; los tejidos en los bloques fueron cortados a 5-6 µm en un Las ratas preñadas se distribuyeron de manera aleatoria micrótomo de rotación Leica 2125RTS, y las secciones en cuatro tratamientos experimentales de 4 individuos obtenidas fueron colocadas en portaobjetos de vidrio, cada uno. Un grupo fue tratado con nifedipino a dosis de con gelatina histológica, y posteriormente se tiñeron por 2 mg/Kg (Cheng et al., 2014), por vía oral, los días 8 a 10 el método de rutina H-E. Las laminillas se observaron en de gestación; otro grupo fue tratado con ácido fólico a un microscopio óptico Leica DM500, acoplado a una dosis de 2.5 mg/kg (Oyama et al., 2009), desde el día 0 cámara fotográfica Leica ES3, se tomaron fotografías y se hasta el 11 de gestación; y al último grupo se le interpretaron éstas. administraron tanto el nifedipino como el ácido fólico, a las mismas dosis, como se describió para cada uno de los Análisis estadístico dos grupos anteriores; al grupo restante se le administró Los resultados paramétricos se analizaron por medio de agua de beber (el vehículo de los fármacos), los días la prueba de ANOVA de dos factores. Cuando fue mencionados, y fue considerado como el grupo testigo o necesario, se aplicó la prueba de LSD. Los resultados no control. De cada sujeto se registró el peso corporal paramétricos se analizaron por medio de la prueba de diariamente, y el día del sacrificio se midió la presión Kruskall-Wallis (Daniel, 2007). Se utilizó el paquete arterial sistólica y diastólica en un pletismógrafo Panlad estadístico SAS 10.0. s.l., LE 5007, y los datos fueron registrados en el programa de cómputo PowerLab. Resultados y discusión Obtención de embriones Presión arterial El día 11.5 de gestación, las hembras preñadas se anestesiaron con pentobarbital sódico a dosis de 100 La presión arterial sistólica y diastólica de ratas tratadas mg/Kg, y antes de la muerte cardiaca se realizó una con los diferentes esquemas se observa en la figura 1. laparotomía. Se obtuvieron el útero y los ovarios, que se Tanto para la presión sistólica como para la diastólica, el enjuagaron en solución salina en frío antes de continuar tratamiento con nifedipino (con o sin ácido fólico), el procedimiento. Se registró el número de embriones y induce una disminución con respecto al control; mientras cuerpos lúteos de los ovarios de cada rata con ayuda de que en el grupo tratado solamente con ácido fólico, la un microscopio estereoscópico Leica MZ6. El útero se presión arterial no es estadísticamente diferente a la del abrió, y se extrajeron los embriones, los cuales se grupo control, lo que corrobora entonces el efecto revisaron cuidadosamente para tratar de detectar antihipertensor del nifedipino. Universidad Autónoma Metropolitana QV94 Revista Tendencias en Docencia e Investigación en Química Año 2 Número 2 Año 2016 sustancial en el porcentaje de implantación, tanto para las ratas que sólo recibieron ácido fólico como para aquellas que estuvieron sometidas a nifedipino (Figura 3). Estos resultados comprueban que el nifedipino no es tóxico sobre el embrión sino que tiene potencial teratógenico. Por otra parte, comprueban que el ácido fólico tiene poder para restaurar el daño embrionario, sin afectar la presión arterial. Figura 1. Presión arterial diastólica y sistólica de ratas SHR hembras con 11.5 días de gestación, sometidas a tratamiento con nifedipino o ácido fólico. Promedio ± desviación estándar de 4 sujetos por grupo. *P < 0.05 con respecto al grupo control (ANOVA bifactorial). Peso corporal Con respecto al peso de las ratas preñadas sometidas a los distintos tratamientos, ninguno de los tres tratamientos afecta la ganancia de peso a lo largo del Figura 3. Porcentaje de implantación en ratas tratadas con experimento (Figura 2), lo que cabe esperar, ya que no se nifedipino y ácido fólico. Promedio ± desviación estándar de 4 ha reportado que el nifedipino o el ácido fólico causen camadas. *P < 0.05 con respecto al grupo control (ANOVA efecto sobre el peso corporal, o sobre la ganancia de peso bifactorial). que se presenta en las hembras en la gestación. Además, las ratas tratadas con nifedipino tuvieron un elevado índice de reabsorciones (30.05 ± 9.93%), mientras que las ratas del grupo control y las sometidas a ácido fólico (con y sin nifedipino) no mostraron ninguna reabsorción; este resultado es estadísticamente significativo (P < 0.001 entre el grupo tratado con nifedipino y el control, por prueba de Kruskall-Wallis). De acuerdo a Ahokas y Sibai (1990), existe una correlación negativa entre presión arterial sistólica y tamaño de camada: es decir, que una alta presión arterial sistólica se correlaciona con un tamaño de camada mayor, por lo cual se trató de encontrar una relación entre ambos parámetros, como se observa en la figura 4. Figura 2. Peso de ratas preñadas desde el día de inicio de la El resultado obtenido mediante análisis matemáticos (r = preñez hasta el día de sacrificio. Por claridad, se omitieron las -0.544) indica que hay una correlación moderada barras de desviación estándar (menores al 5%), y se grafica sólo el promedio de 4 sujetos experimentales. No hay (Daniel, 2007) entre presión arterial y tamaño de diferencias entre grupos. camada. Sin embargo, considerando la condición materna, es probable que haya muchos más factores Porcentaje de implantación metabólicos, endócrinos y fisiológicos no considerados En cuanto a los parámetros reproductivos, el porcentaje en este trabajo, que influyan en el desarrollo fetal. de implantación, es muy bajo para el grupo control, y mejora un poco (no diferente estadísticamente) en el grupo tratado con nifedipino; mientras que la administración de ácido fólico causa un aumento Universidad Autónoma Metropolitana QV95 Revista Tendencias en Docencia e Investigación en Química Año 2 Número 2 Año 2016 un retraso en el desarrollo general de embriones en cultivo in vitro, a mayores concentraciones de nifedipino (14.4 y 28.8 μM); mientras que a concentraciones más bajas (7.2 μM), los embriones presentaron insuficiencia cardiaca, falta de circulación sanguínea y fibrilación auricular-ventricular. El nifedipino, a través de la alteración de las propiedades de los canales de calcio, pueda causar hipoxia, la que a su vez, es la responsable de las malformaciones, el retraso del desarrollo y la muerte embrionaria, evaluado en éste trabajo como reabsorciones, el análogo en roedores de las malformaciones (Abela et al., 2010). Los resultados presentados aquí están en concordancia con esta Figura 4. Correlación entre la presión arterial sistólica y el tamaño de camada; para ambos parámetros se grafica el hipótesis. promedio ± el error estándar de 4 determinaciones. Control o; nifedipino Δ; ácido fólico ⧠; ácido fólico más nifedipino x. Malformaciones embrionarias Los embriones del grupo control presentaron retraso en el desarrollo del primordio cardiaco, desarrollo de cabeza/cerebro y en somitas, tal como lo demuestran Grollman y Grollman. (1962). Las alteraciones en el organismo materno pueden ser responsables de este tipo de trastornos, lo que podría a su vez, provocar hipertensión en su descendencia. Estos resultados son lógicos, ya que se sabe desde hace varios años que en esta cepa de ratas, se ven alterados varios parámetros reproductivos y del desarrollo, como son el tamaño de camada (Ahokas y Sibai, 1990), el número y peso fetal, la mortalidad prenatal y el índice del desarrollo (Peracoli et al., 2001). Figura 5. Embriones de 11.5 días de ratas hembra sometidas a distintos tratamientos. A: control; B: nifedipino; C: ácido fólico; Por otra parte, el tratamiento con nifedipino, además de D: ácido fólico más nifedipino. Se observa que el tratamiento causar reabsorciones, se relaciona también con aparición con nifedipino causa una severa dismorfogénesis, mientras que de malformaciones (Figura 5); las cuales no se observan la administración de ácido fólico sin nifedipino no afecta el en los embriones de las ratas sin tratamiento, o en las desarrollo, y el tratamiento con ácido fólico revierte los daños que causa el nifedipino. sometidas a ácido fólico (con o sin nifedipino). Tomados en conjunto, los datos de las figuras 3, 4 y 5 indican que Score morfológico el nifedipino, a la dosis empleada en este trabajo, es un A los embriones recuperados se les asignó un valor teratógeno potente. numérico de acuerdo a su grado de desarrollo, el que se Esto está en concordancia con lo reportado por Nilsson muestra en la figura 6. Se puede observar que el et al. (2012), quienes demuestran que hubo un severo tratamiento con nifedipino reduce el valor de éste score, deterioro de funciones cardiacas embrionarias debido al mientras que el tratamiento con ácido fólico lo mejora, de efecto inotrópico negativo. Asimismo infirieron que los manera significativa. fármacos que actúan directamente sobre canales iónicos o funciones cardiovasculares, causan teratogénesis en mayor o menor medida. Abela, et al. (2010) registraron Universidad Autónoma Metropolitana QV96 Revista Tendencias en Docencia e Investigación en Química Año 2 Número 2 Año 2016 Figura 6. Score o registro morfológico de los embriones de 11.5 días de desarrollo de hembras SHR sometidas a distintos tratamientos. *P < 0.05 con respecto al grupo control (prueba Figura 7. Cortes histológicos longitudinales de embriones de de Kruskall-Wallis) con respecto al grupo control. 11.5 días de edad gestacional de ratas tratadas con nifedipino (B), ácido fólico (C) y nifedipino más ácido fólico (D); se Valoración histológica muestra un embrión control (A) para fines de comparación. (Elaboración propia). TN: tubo neural; P: prosencéfalo; M: En los cortes histológicos, se observa que efectivamente mesencéfalo; R: rombencéfalo; S: somitas; PC: primordio el nifedipino altera los procesos de desarrollo cardiaco. embrionario que involucran formación del primordio cardiaco (Figura 7). Se aprecia que en los embriones de Se puede decir entonces que el tratamiento con ácido ratas tratadas con nifedipino, el ventrículo y la aurícula fólico se relaciona con un mejor desarrollo en primitivos no están completamente desarrollados en comparación con los grupos a los que no se les todos los casos (Figura 7B); mientras que en los administró el ácido fólico. Tal como indican Oyama et al. embriones de rata tratadas con ácido fólico más (2009) esta biomolécula es un cofactor importante para nifedipino, se ha desarrollado por completo el tubo la síntesis de nucleótidos, por lo cual su insuficiencia cardiaco, y se alcanzan a distinguir ambas cavidades, durante el periodo inicial del desarrollo, blastulación, además de que se esbozan las comunicaciones gastrulación y neurulación, provoca un retraso en el atrioventriculares a cada lado del mismo (Figura 7D). desarrollo embrionario, mientras que una adecuada concentración de ácido fólico tuvo un efecto preventivo En cuanto a los procesos de cierre del tubo neural, en sobre defectos en el desarrollo embrionario. embriones del grupo testigo se alcanzan a ver las cinco vesículas cerebrales (Figura 7A), al igual que en los de Es pertinente hacer notar que en general, los parámetros ratas tratadas con ácido fólico (Figura 7C) y los de ratas reproductivos evaluados en el presente reporte para el bajo tratamiento con ácido fólico más nifedipino (Figura grupo tratado con ácido fólico (sin nifedipino) son 7D), mientras que en algunos de los embriones de las mejores que en el grupo control intacto; lo que quiere ratas tratadas sólo con el antihipertensivo, no se decir que la condición hipertensa produce efectos alcanzaron a desarrollar todas las vesículas, y se deletéreos para la progenie y que el ácido fólico los observan estructuras huecas (Figura 7B). revierte, sin afectar la presión arterial. Tanto los daños cardiacos como neurales son indicativos Conclusiones de alteración de procesos en la etapa de neurulación/organogénesis, como se observa en los • El tratamiento con nifedipino mostró un efecto embriones antes del corte (Figura 5); mientras que teratogénico profundo, ya que causó severos retrasos en cuando se observan las estructuras normales en el desarrollo del tubo neural, primordio cardiaco y embriones tratados con ácido fólico (con o sin somitas. nifedipino), este hallazgo es indicativo de mejoría de • El ácido fólico demostró tener un efecto dichos procesos. embrioprotector significativo sobre el retraso de desarrollo causado por el nifedipino. Universidad Autónoma Metropolitana QV97 Revista Tendencias en Docencia e Investigación en Química Año 2 Número 2 Año 2016 • Adicionalmente, el ácido fólico puede revertir Brown N.A.; Fabro S. (1981). Quantitation of embryonic parcialmente la baja tasa reproductiva que la development in vitro: A morphological scoring system. hipertensión produce en la cepa. Teratology, 26: 65-78. • Existe una correlación moderada entre la presión Cheng Z.-Y., Tian X., Gao, J., Li, H.-M., Jia, L.-J., Qiao H.-J. arterial diastólica y el número de fetos por camada; tal (2014). Contribution of baicalin on the plasma protein vez incluir más hembras en cada grupo pudiera ayudar a binding displacement and CYP3A activity inhibition to comprender mejor dicha correlación. the pharmacokinetic changes of nifedipine in rats in vivo and in vitro. Plos ONE. 9: 371-379. • Para estudios posteriores, se sugiere determinar la presión arterial antes de los tratamientos; es probable Daniel W.W. (2007): Bioestadística, base para el análisis que se obtenga una mejor correlación si se analiza el de las ciencias de la salud. 1a. Ed. Limusa-Wiley, México, cambio en la presión arterial debida al tratamiento (y no D.F. pp. 430-440. con la presión en sí) con el tamaño de camada. Danielsson B.R.G., Reiland S., Rundqvist, E., Danielson M. Agradecimientos (1989). Digital defects induced by vasodilating agents: relationship to reduction in uteroplacental blood flow. Los autores agradecen al Dr. Maximiliano Ibarra Barajas, Teratology, 40: 351–358. de la Unidad de Biomedicina de la FES Iztacala el acceso a las ratas de la cepa SHR, el uso del pletismógrafo, y las Erb C. (2006). Embryology and teratology. En: Suckow, pláticas sobre el uso del aparato y los conocimientos M.A., Weisbroth, S.H. y Frankin, C.L. (editores). The básicos de hipertensión. laboratory rat. 2a. Ed. Academic Press, Amsterdam, pp. 817-846. Se agradece al Biól. Tomás Ernesto Villamar Duque del bioterio de la Facultad el cuidado de los sujetos FDA (U.S. Food and Drug Administration, Consultado 21 experimentales, además de su instrucción en el adecuado de Agosto de (2015). trato hacia con los animales de laboratorio. http://www.fda.gov/Safety/MedWatch/SafetyInformati on/ucm275491.htm). A Jessica Guadalupe Gaona Uribe por adiestrar a los alumnos de metodología en el manejo de técnicas. Grollman A., Grollma, B. (1962). The teratogenic induction of hypertension. J. Clin. Invest. 41: 710-714. Montserrat Pérez Corona ayudó a los autores en la determinación de la presión arterial y la observación de Hernández, J. (2009). Diagnóstico y tratamiento de los embriones. hipertensión arterial en el embarazo. 1a. Ed. Prado. México. p. 533. Dulce Raquel Flores Olmedo ayudó al diseño de las figuras 5 y 7 a partir de las microfotografías. Hibbard E., Smithells R. (1965). Folic acid metabolism and human embryopathy. Lancet 285: 536-538. Referencias Nilsson M., Sköld A., Ericson A., Annas A., Villar R., Cebers Abela D., Ritchie H., Ababneh D., Gavin C., Nilsson M., G., Hellmond H., Gustafson A., Webser W. (2012). Khan M., Carlsson K., Webster W. (2010). The effect of Comparative effects of sodium channel blockers in short drugs with ion channel-blocking activity on the early term rat whole embryo culture. Toxicol. Appl. Pharmacol. embryonic rat heart. Birth. Def. Res. 89: 429-440. 272: 306-312. Ahokas R.A., Sibai, B.M. (1990). The relationship between Oyama K., Sugimura Y., Murase T., Uchida A., Hayasaka S., experimentally determined litter size and maternal Oiso Y., Murata Y. (2009). Folic acid prevents congenital blood pressure in spontaneously hypertensive rats. Am. malformations in the offspring of diabetic mice. Endocr. J. Obstet. Gynecol. 162: 841-847. J., 56: 29-37. Aluclu M., Tuncer M., Guzel A., Aluclu M., Akkus M. (2009). Peracoli J. C., Viera C. R. M., Salete S. M., da Silva F. R. J. The effects of valproic acid on sciatic nerve of fetal rats (2001). Effects of hypertension on maternal adaptations and protective effects of folic acid and vitamin E. Int. J. to pregnancy: experimental study on spontaneously Morphol., 27: 285-294. hypertensive rats. Sao Paulo Med. J., 119: 54-58. Universidad Autónoma Metropolitana QV98 Revista Tendencias en Docencia e Investigación en Química Año 2 Número 2 Año 2016 Pagano M. (1991). Prescripción de fármacos en el Embarazo. 1a. Ed. Interamericana. México, D.F. pp. 19-45. Rivera C.C., Hernández G.R., Marin S.H. (2013). Manejo reproductivo de las colonias de rata espontáneamente hipertensa (SHR) y su control normotenso Wistar Kyoto (WKY) en el bioterio del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México. Redvet 14, 11B (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n11113B. htm; consultado el 12 de enero de 2015). Voto L. (2008). Hipertensión en el Embarazo. 1a. Ed. Corpus. Argentina. pp. 45-47, 232. 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